L’ubiquitine
L'ubiquitine est une protéine compacte, globulaire et très stable de 76 acides aminés (8 kDa), produite à partir d’un polypeptide précurseur, présent dans toutes les cellules eucaryotes (Pickart CM 2004). Elle a une conformation de type « β-grasp superfold » formée de cinq feuillets beta (β) connectés et stabilisés par deux hélices alpha (α), selon la séquence ββαββαβ. Elle contient sept Lysines, une région hydrophobique incluant les résidus L8, V70 and I44, et un C-ter flexible avec une glycine en position 76 (G76) (Figure 7). L’ubiquitine est souvent exprimée comme une succession de plusieurs molécules liées de manière covalente les unes aux autres, qu’on appelle « chaine d’ubiquitine ». Elle modifie de façon post-traductionnelle une protéine-cible par le processus d'ubiquitination. Ce processus, qui a été
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découvert dans les années 1980 par Ciechanover et Hershko (Ciechanover A 1980) (Hershko A 1983), est utilisé aussi bien par les bactéries que par les levures, les plantes et les animaux.
Le processus d’ubiquitination
La conjugaison de l'ubiquitine aux substrats se fait par une cascade enzymatique impliquant au moins trois types de facteurs (Figure 8):
- L’enzyme E1 effectue l'activation de l'ubiquitine, dépendante de l’ATP, en formant une liaison thiol-ester entre la glycine C-terminale de l'ubiquitine G76 (via le COOH porté par son carbone α) et le groupement thiol (SH) d'une cystéine de l'E1;
- L’enzyme E2 de conjugaison de l'ubiquitine transfère l'ubiquitine activée au niveau du groupement thiol de sa cystéine active, réalisant une liaison instable;
- L'enzyme E3, une ubiquitine-ligase, favorise le transfert de l'ubiquitine de l'E2 vers le substrat par formation d'une liaison isopeptidique amide entre le groupement COOH de G76 et le groupement ε-amine d'une lysine du substrat. L’E3 se comporte donc comme un récepteur, sélectionnant et présentant à l'E2, la protéine cible.
Figure 7. Structure tertiaire de l'ubiquitine. Les sept Lysines sont indiquées en rouge et la section hydrophobique contenant L8–I44– V70 est en jaune. (F. D. Pickart CM 2004)
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Les différentes familles d’E3
L'E3 est très important puisqu'il est en grande partie responsable de la spécificité de la réaction, de par son implication dans la reconnaissance spécifique du substrat. C’est pour cela qu'il existe environ 700 E3s différentes chez les mammifères, alors que l'on ne compte qu'une trentaine d'E2s et que deux E1s.
Il existe deux grandes familles d’E3 qui fonctionnent distinctivement durant le processus d’ubiquitination (Ardley HC 2005).
La famille des E3s à domaine HECT (Homologous to E6-associated protein C-Terminus) joue un rôle direct dans la conjugaison de l'ubiquitine au substrat. L'ubiquitine activée est en effet transférée de l'E2 sur un résidu cystéine de l'E3 avant d'être conjuguée au substrat. A ce jour, une vingtaine de membres de cette famille a été découverte chez l'Homme. La famille des E3s à domaine RING (Really Interesting New Gene) contient des protéines se comportant comme des molécules d'échafaudage plutôt que de véritables enzymes. En effet, elles servent de molécules adaptatrices entre l'E2 et le substrat en les rapprochant pour faciliter l’ubiquitination du substrat. Le motif "RING finger" les caractérisant forme des boucles stabilisées par coordination d'ions Zinc et permet le recrutement des E2s. Cette famille comporte des centaines de membres.
Figure 8. Le processus d’ubiquitination. Les différentes étapes requises pour modifier un substrat par mono- ou polyubiquitination sont indiquées. Ub: ubiquitin, E1: ubiquitin activating enzyme, E2: ubiquitin conjugating enzyme, E3: ubiquitin ligase.
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Les différents types d’ubiquitination La monoubiquitination
Les protéines peuvent être modifiées par la liaison covalente d'une seule ubiquitine, sur un ou plusieurs résidus du substrat (multi-monoubiquitination) (Figure 9). Cette modification tient un rôle important dans des fonctions très variées telles que la signalisation cellulaire, la réparation de l'ADN, la régulation de la localisation de certaines protéines, l'internalisation des récepteurs membranaires et le remodelage de la chromatine via la modification des histones pour le marquage épigénétique.
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La polyubiquitination
L’ubiquitine possède sept lysines (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63) permettant le processus de polyubiquitination (Pickart CM 2004). La première molécule d'ubiquitine est conjuguée à une lysine du substrat. L'élongation de la chaîne de polyubiquitine se fait ensuite par la formation d'une liaison isopeptidique entre la glycine C-terminale d'une nouvelle ubiquitine et une lysine de la molécule d'ubiquitine précédemment conjuguée. Le nom donné au type de chaînes synthétisées décrit le résidu Lysine utilisé sur l’ubiquitine. Ces chaines peuvent présenter des topologies variées et remplissent de fonctions spécifiques.
Les lysines de l'ubiquitine sont exposées à sa surface et libres de se lier. Il peut donc se former différentes chaînes, de type et de topologie variés (Figure 9). Ces chaines sont impliquées dans la protéolyse cellulaire, l'endocytose et la réponse inflammatoire (Figure 10).
Les chaines K48, par exemple, entraîne l'adressage de la protéine modifiée au protéasome 26S pour dégradation. Une chaîne d'au moins quatre molécules représente le signal de dégradation. C'est le processus le plus classique et connu de l'ubiquitination.
Les chaînes K63, quant à elles, n’entraînent pas la dégradation par le protéasome de la protéine auxquelles elles sont liées. Au contraire, elles sont reconnues par des domaines d’interaction spécifiques que contiennent certaines protéines. Cela permet d’obtenir un niveau
Figure 10. Les différents types d'ubiquitination et exemples de leurs fonctions cellulaires. (Wang G 2012)
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de contrôle des interactions protéine-protéine et de réguler la signalisation intracellulaire notamment (Figure 10).
Plus récemment il a été identifié un autre type de chaines de polyubiquitine dit « linéaire » (Figure 10). Dans ce cas, la liaison di-ubiquitine a lieu entre Gly76 d’une ubiquitine et Met1 de l’ubiquitine suivante. Ces chaines ont également une fonction dans la signalisation intracellulaire, telle que présentée ci-dessous.
La déubiquitination
De la même façon que le niveau de phosphorylation des protéines peut être régulé par leur déphosphorylation, l'ubiquitination des protéines peut être contrecarrée par leur déubiquitination. Les liaisons inter-ubiquitine sont clivées par des enzymes de déubiquitination (protéases) appelées DUB (DeUBiquitinating enzymes), regroupées dans cinq familles selon leur structure (Komander D 2009) (Clague MJ 2012). Cette étape permet aussi le désassemblage des chaînes de polyubiquitine, la maturation de l'ubiquitine à partir de ses précurseurs et un "contrôle qualité" afin d'éviter la production d'ubiquitine monomérique mal traduite ou mal conformée. Ce processus est donc impliqué dans la protéolyse, la régulation post-traductionnelle, la localisation ou la fonction de certaines protéines.
La plus grande famille de DUBs est celle des USPs (Ubiquitin Specific Peptidase), avec 55 membres chez l’Homme, ce qui correspond à plus de 50% du nombre total de DUBs (Komander D 2009) (Clague MJ 2012) (Kovalenko A 2003). Certaines sont sous forme inactive et vont subir un changement conformationnel grâce à leur liaison à l’ubiquitine, ce qui permettra leur activation, de manière ciblée (Komander D 2009). Un exemple d’USP ayant un rôle dans l’inactivation de la voie NF-κB est CYLD, qui peut hydrolyser les chaines K63 ou linéaires, et agit ainsi sur RIPK1, NEMO, et TRAF2 (voir la section Discussion) (Kovalenko A 2003). De même, USP2 peut agir au niveau de RIPK1 (Mahul-Mellier AL 2012).
La famille des Ubiquitin C-terminal Hydrolases (UCHs) est quant à elle, composée de quatre protéines ayant un domaine catalytique assez similaire. Ce sont les premières DUBs qui ont été décrites, et elles joueraient un rôle dans le recyclage de l’ubiquitine mal conjuguée et dans l’hydrolyse de précurseurs d’ubiquitine (Baek KH 2003).
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La famille des protéases Machado Joseph Disease (MJD) est composée d’environ trente protéines (Li X 2015), telle que l’ataxin 3 dont la mutation est associée à la maladie héréditaire et neurodégénérative Machado-Joseph (Li X 2015). Son domaine catalytique a peu d’homologie de séquence avec celui des autres DUBs connues, mais l’arrangement général de la triade catalytique (résidus cystéine, histidine et aspartate) est conservé (Mao Y 2005). Cette famille, tout comme celles des Ubiquitin Specific Peptidase (USPs) et celle des Ubiquitin C-terminal Hydrolases (UCHs) sont des protéases à cystéine. L’activité enzymatique de ces protéases est permise par le groupement thiol d’une cystéine du site actif, ce qui va entrainer la libération du substrat et la formation d’un intermédiaire covalent entre la DUB et la molécule d’ubiquitine.
Les Ovarian Tumor proteases (OTUs) ont une histidine et une cystéine conservées au niveau du site actif. Le troisième résidu nécessaire à la triade catalytique semble être un aspartate, comme pour les protéases à cystéine. Néanmoins, les homologues chez Drosophila melanogaster d’OTUD4 humain, présentent une sérine au lieu d’une cystéine (Louis M 2015). Ce genre de protéases à sérine a été peu analysé, ce qui entraine que cette famille de DUBs reste mal définie même s’il a été prouvé que des OTUs présentent bien une activité déubiquitinase
in vitro (Reyes-Turcu FE 2009). Comme les USPs, les OTUs prennent une conformation active
à partir du moment où elles se lient à l’ubiquitine (Edelmann MJ 2009). A20 est une protéine appartenant aux OTUs et a une double activité enzymatique (DUB/E3 ligase) codée par un gène induit par NF-κB (Wertz I 2014). Elle est supposée arrêter le processus d’activation de NF-κB en déubiquitinant RIPK1, puis en la dégradant. OTULIN a aussi être démontrée comme appartenant aux OTUs, avec une affinité spécifique pour les chaines linéaires d’ubiquitine, ce qui contre l’activité de LUBAC (Keusekotten K 2013).
La cinquième famille est celle des métalloprotéases nommées
JAB1/PAD1/MPN-domain-containing Metalloenzymes (JAMM) qui ont besoin de la présence d’ions Zn2+ pour
leur activité protéolytique (Komander D 2009). Contrairement aux protéases à cystéine, ces DUBs génèrent un intermédiaire non-covalent avec l’ubiquitine (Nijman SM 2005).
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