Les lymphocytes T régulateurs contrôlent la réponse immunitaire. Je me suis donc intéressée à cette population au site tumoral en les étudiant par immunohistochimie.
Matériel et méthodes
Construction des Tissue MicroArrays
Des Tissus MicroArrays (TMA) ont été construits en ciblant deux zones représentatives de la tumeur : le centre de la tumeur (CT) et le front de progression (FP). Les carottes de 0,6 et 1 mm de diamètre pour, respectivement le centre et le front de progression, ont été faites dans des blocs de tissu en paraffine et insérées dans un nouveau bloc de paraffine. Les TMA ont été ensuite coupés en section de 5µm pour les marquages immunohistochimiques.
Immunohistochimie
Après le démasquage antigénique à pH8, l’inhibition des peroxidases endogènes et la satura- tion, les coupes ont été incubées une heure à température ambiante avec les anticorps CD45RO (OPD4), mast cell tryptase (AA1), granulocyte (BM-2), CD3 (SP7 ; neomarker, Fremont, CA), FoxP3 (ab20034 ; abcam, Cambridge, Angleterre), CD68 (PGM1), CD20 (L26 ; Dako Copenhagen, Dane- mark), IL3RA (IL3RA), IL23 (IL23 ; Atlas Antibodies, Stockholm, Suède) et IL17 (H-132 ; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Le système Envision+ (polymères couplés à une enzyme) et le chromogène DAB sont ensuite appliqués (Dako, Copenhagen, Danemark). Les lames sont analy- sées à l’aide d’une station d’analyse d’images (SpotBrowser, Alphelys, Plaisir, France). La densité
FIGURE11 – Un exemple de marquage de cellules FoxP3+ en marron (gauche) et son analyse digitale
(droite) effectué par le logiciel d’analyse d’image SpotBrowser. Les cellules FoxP3+ sont représentées en rouge et le tissu en jaune. La densité de cellules FoxP3+ est calculé en effectuant le rapport nombre de cellules positives sur surface de tissu (mm2).
visualiser l’influence des paramètres sur la survie sans récidive des patients. p≤0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. Toutes ces analyses ont été faites avec les logiciels statistiques R et Statview.
Résultats
Les lymphocytes T régulateurs
J’ai effectué le marquage des cellules FoxP3+ et analysé les images obtenues (Figure 11). Le logiciel SpotBrowser compte le nombre de cellules FoxP3 (représentées en rouge) ainsi que la surface du tissu (représenté en jaune). Ses données permettent de calculer la densité de cellules dans chaque spot de tissu. Une moyenne des différents spots de chaque région de la tumeur pour chaque patient est ensuite calculée. Des données ont été obtenues pour 464 patients au centre de la tumeur et pour 471 patients au front de progression. 428 patients possèdent des données pour les deux régions de la tumeur.
FIGURE12 – Courbes de survie sans récidive associées à la densité de cellules FoxP3+. Pour chaque
FIGURE 13 – Matrice de corrélation avec classement hiérarchique non supervisé des densités de
cellules immunitaires au centre (CT) et front de progression (IM, Invasive Margin) de la tumeur. Les coefficients de corrélation de Pearson sont visualisés en vert pour une corrélation négative (R=-1), en rouge pour une corrélation positive (R=1) et en blanc pour une absence de corrélation (R=0).
sont discordantes. Le groupe de patients fortement infiltrés dans les deux régions (courbe rouge) en cellules FoxP3+ ont une meilleure survie sans récidive que le groupe de patients faiblement infiltrés dans les deux régions (courbe noire, p=0,005). Le groupe de patients faiblement infiltrés dans le centre de la tumeur et fortement infiltrés dans le front de progression (Lo Hi, courbe verte) a une courbe de survie sans récidive superposable à celle du groupe de patients faiblement infiltrés dans les deux régions. Le groupe de patients fortement infiltrés dans le centre de la tumeur et faiblement infiltrés dans le front de progression (Hi Lo, courbe bleue) ont une courbe de survie intermédiaire. Cinq ans (60 mois) après la chirurgie, le pourcentage des patients sans récidive est respectivement de
FIGURE14 – Représentation graphique de la densité de cellules CD3+ et FoxP3+ dans chaque région
de la tumeur. Chaque point représente un patient.
entre les différentes densités des cellules immunitaires dans le centre (CT) et le front de progression (IM) de la tumeur. La matrice est visualisée à l’aide du logiciel Genesis. Les fortes corrélations posi- tives sont visualisées en rouge, les fortes corrélations négatives en vert et l’absence de corrélation en blanc. La matrice est classée hiérarchiquement de manière non supervisée.
On observe deux grands groupes de cellules au sein de la matrice. Dans chaque groupe, les cellules immunitaires proviennent de la même région de la tumeur. La première (en haut, à gauche) est consti- tuée de densité provenant majoritairement du front de progression, à l’exception du marqueur FOXP3 dont les deux zones sont représentées. On y retrouve les marqueurs lymphocytaires CD3, CD8, CD57 et FoxP3 ainsi que les vaisseaux lymphatiques (podoplanine). Le deuxième cluster contient les mêmes marqueurs, au front de progression.
Les cellules FoxP3+ font partie d’un cluster comprenant des lymphocytes T au centre de la tumeur. Le bon pronostic associé à la densité de FoxP3 pourrait être la conséquence d’une corrélation avec la présence de lymphocytes T cytotoxiques ou Th1. Or, les graphiques ne montrent pas de relation nette entre la densité de cellules FoxP3+ et celle de cellules CD3+ (figure 14. Le rapport des densités de cellules FoxP3+ sur celles de cellules CD3+ le confirme (figure 15). Il est variable. En effet, certains patients présentent des cellules CD3+ sans cellule FoxP3+ (rapport égal à 0%), tandis que d’autres
FIGURE 15 – Représentation graphique de la répartition du rapport des densités de cellules FoxP3+
et CD3+ en pourcentage, dans chaque région de la tumeur.
(p=0,06). Les patients avec un ratio élevé dans les deux régions de la tumeur ont une meilleure survie sans récidive que les patients avec un faible ratio dans les deux régions. Les patients avec un ratio discordant entre les deux régions de la tumeur ont une survie sans récidive intermédiaire.
Les lymphocytes T régulateurs et les lymphocytes Th17
Les lymphocytes Th17 sont de mauvais pronostic (article 4). Les lymphocytes T régulateurs pour- raient contrôler l’inflammation induite par les lymphocytes Th17. J’ai fait le rapport densité de cel- lules FoxP3+ sur celle de cellules IL17+ (figure 17). Tous les cas de figures sont rencontrés : Cer- tains patients n’ont pas de cellules FoxP3+ et des cellules IL17+ (ratio=0), d’autres ont des cellules FoxP3+ et pas de cellules IL17+. Ces derniers cas sont répertoriés dans le groupe ratio≥10. Trois groupes de patients sont facilement identifiables sur le graphique représentant la répartition du ratio FoxP3+/IL17+ (figure 17) : Ceux avec un ratio inférieur à 0,001 (nommés "lo"), ceux avec un ratio supérieur à 10 ("Hi") et ceux avec un ratio intermédiaire ("Int"). Ces groupes sont valables pour le centre et le front de progression de la tumeur.
FIGURE 17 – Représentation graphique de la répartition du rapport des densités de cellules FoxP3+
FIGURE18 – Courbes de survie sans récidive associées au ratio des densités de cellules FoxP3+ sur
celles des cellules IL17+. Pour chaque région de la tumeur, les patients sont classés en groupe avec un ratio fort (Hi, courbe en rouge), intermédiaire (Int, courbe bleu) ou faible (Lo, courbe en noir). Ces groupes sont ensuite combinés. Les patients avec un fort ratio (Hi Hi) dans les deux régions sont
FIGURE 19 – Deux exemples de microARNs différentiellement exprimés sont représentés. Les ni-
veaux d’expression relatifs sont comparés dans les tissus tumoraux (barre jaune) par rapport aux tissus sains (barres bleu).