des cellules
D. Localisation physique de la tubuline γγγγ au noyau.
Sur la base des résultats obtenus jusqu’ici, il nous est apparu intéressant d’enquêter sur la localisation nucléaire précise de la tubuline-γ. En sachant que Rad51 et γH2AX font partie d’un complexe commun à la tubuline-γ, la première localisation à vérifier est la proximité de la CDB. La technique qui se prête le mieux à l’obtention de cette information est l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). La lignée cellulaire sur laquelle nous avons réalisé les manipulations est la lignée RG37, que nous avions utilisée dans les études sur la Recombinaison Homologue in vivo. Cette lignée se montrait très appropriée pour cette approche puisque dans ce système nous pouvons induire une CDB de façon ciblée.
L’induction d’une CDB ciblée est le résultat d’une série d’événements : d’abord le plasmide codant l’endonucléase I-SceI doit entrer dans la cellule ; ensuite il faut que l’endonucléase soit produite pour pouvoir réaliser la coupure, étape cruciale pour retrouver sur le site de la coupure les protéines impliquées dans sa réparation. Donc, il faut d’abord contrôler que toutes les étapes précédant la coupure se soient produites. Nous avions déjà mis au point la transfection du plasmide codant I-SceI mais la cinétique d’expression de l’endonucléase n’avait pas été contrôlée. Pour cela nous avons transfecté les cellules avec un plasmide codant une forme de l’endonucléase I-SceI qui est en fusion avec la protéine c-Myc. Nous avons effectué des extractions de protéines totales à des temps différents après la transfection et analysé l’expression de l’endonucléase par Western Blot en utilisant des anticorps dirigés contre la protéine c-Myc. La Figure 52 montre qu’une expression détectable de l’endonucléase est obtenue 8h après la transfection ; sa concentration continue à augmenter dans le temps et elle reste quantitativement importante jusqu’à plus de 32h après transfection. Ce résultat indique clairement que nos expériences d’immunoprécipitation de la chromatine doivent se répartir entre 12h et 28h après la transfection du vecteur.
I-SceI - + + + + + + + + - tubuline-αααα - c-Myc NT 4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h 32h RG37 temps post-traitement
Figure 52. Cinétique d’expression de l’endonucléase I-SceI après transfection. Pour les détails suivre le texte.
I-SceI - + + + + + + + + - tubuline-αααα - c-Myc NT 4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h 32h RG37 temps post-traitement I-SceI - + + + + + + + + - tubuline-αααα - c-Myc NT 4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h 32h RG37 temps post-traitement
Figure 52. Cinétique d’expression de l’endonucléase I-SceI après transfection. Pour les détails suivre le texte.
Après avoir réalisé cette expérience préliminaire et en ayant déjà vérifié que la transfection du plasmide codant I-SceI n’influence pas l’expression de la tubuline-γ (voir section II.B), nous avons commencé la mise au point du protocole de ChIP.
La ChIP est une technique extrêmement complexe qui implique des nombreuses étapes. Nous nous sommes inspirés du protocole de ChIP établi par la société Upstate en apportant des modifications, indispensables pour l’application à notre système cellulaire.
Le principe de base de cette technique consiste dans la fixation des composants cellulaires avant l’extraction des protéines, pour assurer que les complexes existant physiologiquement peuvent être récupérés intégralement par une simple immunoprécipitation ; si la protéine d’intérêt (dans notre cas, la tubuline-γ) est associée directement ou indirectement à l’ADN, celui-ci fera partie du complexe immunoprécipité. Le protocole prévoit donc une étape d’inversion de la fixation après l’étape d’immunoprécipitation, suivi d’une extraction de l’ADN. Pour vérifier que la protéine d’intérêt est associé à la CDB, le protocole se conclut avec une amplification par PCR quantitative de l’ADN extrait, en utilisant des oligonucléotides qui s’apparient à proximité de la lésion et, comme contrôle négatif, des oligonucléotides qui s’apparient sur un gène quelconque de référence (dans notre cas, nous avons choisi le gène codant l’actine).
Une des étapes les plus importantes de cette technique est l’optimisation de la sonication des extraits cellulaires, pour fragmenter l’ADN dans des fragments d’environ 500 paires de bases, puisque des fragments plus petits seront perdus pendant les étapes suivantes et des fragments plus grands réduisent considérablement l’efficacité de l’immunoprécipitation. Après avoir mis au point la sonication, en contrôlant la longueur des fragments d’ADN sur un gel d’agarose, il est indispensable d’optimiser la spécificité de l’immunoprécipitation. Pour cela sont très
importantes les étapes de saturation des protéines G, utilisées pour l’immunoprécipitation, de clarification de l’extrait protéique, pour éliminer les débris cellulaires, et de lavage avant l’élution de l’immunoprécipité. Les détails de ce protocole sont décrits dans Matériels et Méthodes.
L’analyse des données obtenues par PCR quantitative permet de calculer la quantité relative des molécules de tubuline-γ associée à l’ADN sur le site de la cassure, en fonction du temps après la transfection du plasmide codant I-SceI. Les valeurs obtenues par PCR, relatives à l’association de la tubuline-γ au gène codant la GFP sont normalisées avec les valeurs relatives à l’association de la tubuline-γ au gène codant l’actine (gène de référence). Les résultats de cette analyse sont reportés dans l’histogramme en Figure 53.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 mock T0 T16 T20 T24 T28 Te mps post-traite me nt a ss o c ia ti o n r e la ti v e
Figure 53. Analyse du ChIP anti-tubuline-γγγγ. L’histogramme représente l’enrichissement en tubuline-γ à proximité de la cassure double-brin, normalisé contre l’enrichissement au gène de l’actine. Les moyennes et les barres d’erreurs ont été calculés sur une expérience en triplicata et deux expériences en duplicata (n=7, t-test, P<0,05).
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Figure 53. Analyse du ChIP anti-tubuline-γγγγ. L’histogramme représente l’enrichissement en tubuline-γ à proximité de la cassure double-brin, normalisé contre l’enrichissement au gène de l’actine. Les moyennes et les barres d’erreurs ont été calculés sur une expérience en triplicata et deux expériences en duplicata (n=7, t-test, P<0,05).
L’histogramme montre clairement que la tubuline-γ est recrutée au site de la CDB. De plus, les temps que nous avons choisis pour l’observation nous permettent d’ajouter que le recrutement ne se réalise que 24h après la transfection du vecteur. Le fait que, à tous les autres temps d’observation, nous ne révélons pas de recrutement, nous suggère la possibilité que la
liaison de la tubuline-γ au site de la cassure soit temporellement contrôlée ; nous pouvons spéculer que le recrutement soit lié à un mécanisme d’inhibition ou que la tubuline-γ compète avec d’autres protéines pour la liaison à l’ADN.
IV. ETUDE DU ROLE DE RAD51 DANS LE RECRUTEMENT DE LA
TUBULINE-γγγγ AU NOYAU.
INTRODUCTION.
Pour essayer de comprendre si la présence de la tubuline-γ au noyau est liée directement à Rad51 et/ou son rôle dans la Recombinaison Homologue, nous avons utilisé deux systèmes cellulaires différents permettant soit d’exprimer une forme dominante négative de Rad51 soit de diminuer l’expression de la protéine sauvage.
L’élément fonctionnel dans l’initiation de la recombinaison est le filament nucléoprotéique Rad51-ADN. Celui-ci peut être rendu inactif par l’expression soit d’une protéine mutée (393) soit d’une protéine d’une autre espèce (394). En effet, le groupe de M. Jasin a exprimé dans des cellules embryonnaires de souris un gène Rad51 muté dans le site de l’ATPase, construit par l’équipe de S. Takeda (395). Stark et coll. ont ainsi montré que la présence de la protéine mutée inhibait la Recombinaison Homologue en dépit de la présence de la protéine sauvage dans les cellules ES. Le groupe de B. Lopez a montré que la présence d’une protéine Rad51 d’une autre espèce, en l’occurrence celle de Saccharomyces cerevisiae plus grande que la protéine de mammifère, ou la protéine chimère qu’il a construite par addition des 55 aminoacides de l’extrémité N-terminale de la protéine de Saccharomyces cerevisiae à la protéine de souris, inhibait la Recombinaison Homologue conservative. La présence de ces filaments nucléoprotéiques mixtes dans les cellules les rend déficientes dans cette voie de réparation.
La première approche que nous avons entreprise pour comprendre le rôle possible de Rad51 dans le recrutement de la tubuline-γ a été une étude par immunofluorescence de la colocalisation des foyers nucléaires de Rad51 et de tubuline-γ, comme celui utilisé précédemment (140). Ce protocole de marquage particulier, mis au point dans l’équipe de M. Wright (voir Matériels et Méthodes) permet d’observer en même temps des foyers nucléaires de Rad51 et de la tubuline-γ ; en effet, avec les protocoles communs, le marquage de la
tubuline-γ présente au noyau devient impossible, en raison de sa présence abondante dans le cytoplasme.