Le cancer du sein représente un des cancers les plus communs chez la femme. Environ 5-10% d’individus qui développent ce type de cancer sont prédisposés génétiquement à la maladie et dans 10-30% des cas, la prédisposition a été attribuée à une mutation dans le gène codant BRCA2. Les données les plus récentes indiquent qu’une mutation dans BRCA2 détermine 50% de risque de développement d’un cancer avant l’âge de 50 ans et 80% de risque avant l’âge de 70 ans. Des mutations dans BRCA2 prédisposent aussi au développement du cancer de l’ovaire et d’autres types de tumeurs.
Une perte des deux allèles codant BRCA2 peut causer aussi l’Anémie de Fanconi (FA) (voir ci-dessous) (199). Une découverte intéressante et récente a révélée que les lignées cellulaires dérivées de patients atteints par la FA du groupe de complémentation D1, portent une mutation bi-allélique dans BRCA2 ; cela indique que BRCA2 et FANCD1 sont le même gène (200).
Rôle de BRCA2 dans la recombinaison mitotique.
Le gène codant BRCA2 a été identifié en 1995 (201) et son interaction directe avec Rad51 a été observée pour la première fois dans la souris en 1997, avec le système du double-hybride en utilisant un segment de la protéine BRCA2, extrait de sa région C-terminale (202). L’année suivante a été montrée l’interaction directe entre les deux protéines endogènes par co-
immunoprécipitation (203, 204). Des études par immunofluorescence ont montré que Rad51 et BRCA2 colocalisent dans des foyers nucléaires, dans des cellules somatiques après traitements par des radiations ionisantes. En particulier, il a été montré qu’une protéine BRCA2 fonctionnelle est nécessaire pour la formation de foyers de Rad51 après induction des dommages sur l’ADN, ce qui suggère que BRCA2 est indispensable pour le recrutement de Rad51 au site de la CDB (142).
En accord avec toutes ces données, des cellules murines ou humaines déficientes en BRCA2 présentent une instabilité génomique spontanée ; cela peut être lié à une accumulation des cassures chromosomiques, probablement dues à des défauts dans la réparation des CDBs associées à la réplication (205).
Des orthologues de BRCA2 ont été identifiés dans une variété d’organismes même très différents du point de vue évolutif. La protéine BRCA2 humaine est un grand peptide de 384 kDa et contient un certain nombre de motifs qui sont reconnaissables dans tous ses orthologues. Les domaines les mieux caractérisés sont les motifs BRC et l’extrémité C- terminale (Figure 13).
motif BRC motif PhePP domaine à hélice région OB région TR2
Figure 13. Représentation schématique de la protéine BRCA2 humaine (hBRCA2), de souris (mBRCA2) et de poulet (cBRCA2). Pour les détails suivre le texte. (D’après Thorslund T and West SC, 2007).
motif BRC motif PhePP domaine à hélice région OB région TR2 motif BRC motif PhePP domaine à hélice région OB région TR2 motif BRC motif PhePP domaine à hélice région OB région TR2
Figure 13. Représentation schématique de la protéine BRCA2 humaine (hBRCA2), de souris (mBRCA2) et de poulet (cBRCA2). Pour les détails suivre le texte. (D’après Thorslund T and West SC, 2007).
Les motifs BRC sont de séquences dégénérées d’environ 70 aminoacides, contenant un cœur d’environ 25 aminoacides. Le nombre des domaines BRC diffère entre les protéines BRCA2 de différentes espèces. La protéine BRCA2 humaine possède huit motifs BRC. La présence constante de ce motif est indicative de son importance due probablement à sa capacité de lier Rad51. Les interactions entre Rad51 et différents segments de BRCA2, contenant différents motifs BRC, ont été étudiées avec le système du double-hybride et des essais de pull-down, en utilisant des protéines marquées (206, 207). Ces études ont permis de découvrir que les
différents motifs se lient à Rad51 avec des affinités variées, ce qui reflète probablement le degré de divergence évolutive des séquences consensus BRC. Le motif qui montre la meilleure affinité pour Rad51 est BRC4.
Mais la conservation des ses motifs donne aussi une autre information : probablement ils interagissent avec une région unique dans Rad51 (206). La structure d’un peptide comprenant BRC4 et Rad51 a été résolue par cristallographie et elle a montré que BRC4 se lie à Rad51 en reproduisant le motif structural qui est impliqué dans l’interaction entre les monomères de Rad51 et responsable de leur oligomérisation (208). En accord avec ce résultat, il a été montré que BRC4 interagit avec Rad51 et forme un hétérodimère stable qui ne peut pas lier l’ADN (209). Ce complexe Rad51/BRC4 a été ultérieurement étudié et les résultats ont montré qu’il peut empêcher la formation du filament présynaptique si BRC4 se trouve en excès molaire par rapport à Rad51 ; à concentrations molaires plus basse et en présence d’un analogue d’ATP non-hydrolysable, BRC4 se lie au filament de Rad51 formé sur un ADN double-brin (210, 211). Donc, les motifs BRC sur BRCA2 ont très probablement une fonction régulatrice sur la stabilité du filament de Rad51. La liaison des monomères inactifs de Rad51 aux motifs BRC, pourrait être importante pour séquestrer Rad51 à des moments précis pendant le cycle cellulaire.
A ce sujet, les études réalisées sur une lignée cellulaire cancéreuse pancréatique déficiente en BRCA2, les cellules CAPAN-1, ont été indicatives. Ces cellules sont hypersensibles au Méthyle Méthane sulfonate (MMS) et à d’autres agents endommageant l’ADN ; elles ont perdu un allèle BRCA2 et produisent une protéine tronquée à qui manquent les deux derniers motifs BRC et l’extrémité C-terminale contenant le domaine de liaison à l’ADN simple-brin et un autre domaine de liaison à Rad51 (212). Ces cellules ne sont pas capables de former des foyers de Rad51 après traitement aux radiations ionisantes, ce qui indique l’importance de l’extrémité C-terminale de BRCA2 (141). Il faut aussi remarquer que l’extrémité C-terminale contient une séquence NLS (signal de localisation nucléaire) alors que Rad51 ne possède pas une telle séquence.
Des expériences ultérieures ont confirmé que le rôle primaire de BRCA2, après la formation d’une CDB, est d’adresser Rad51 à l’ADN simple-brin généré au site de la cassure et que certains motifs BRC et le domaine C-terminal sont indispensables pour cette activité (213). En particulier, le domaine de liaison à Rad51, localisé à l’extrémité C-terminale de BRCA2 et appelé région TR2, est extrêmement importante : une délétion de l’exon qui code ce domaine augmente énormément l’incidence de cancer (214). Il a été montré que la Ser3291 de la région TR2, est phosphorylée par les Cdks pendant la phase G2 tardive du cycle cellulaire et
que cette phosphorylation empêche la liaison avec Rad51 ; probablement, de cette façon, la cellule inhibe la HR quand elle s’approche de la division mitotique. De plus il a été montré que la Ser3291 est déphosphorylée après traitement aux radiations ionisantes, probablement pour réactiver la HR et pouvoir répondre aux dommages causés (215) (Figure 14).
Des résultats récents ont révélé que l’interaction de la région TR2 avec Rad51 est physiquement et fonctionnellement distincte de celle réalisée par les motifs BRC. La région TR2, en effet, ne peut pas lier les monomères de Rad51, mais reconnaît seulement les anneaux ou les filaments de Rad51 (216).
Il semblerait donc que les motifs BRC et la région TR2 collaborent pour stabiliser et déstabiliser les filaments de Rad51 et cette activité pourrait être régulée par l’état de phosphorylation de la Ser3291, qui répond à la phase du cycle cellulaire et/ou à la présence des CDBs (Figure 15). Activation de la Recombinaison Homologue Désactivation de la Recombinaison Homologue Phosphorylation de la Ser3291 Déphosphorylation de la Ser3291 TR2 Rad51
Stabilisation du filament présynaptique
TR2 P
Rad51
Déstabilisation du filament présynaptique
Figure 14. Stabilisation du filament présynaptique par l’extrémité C-terminale de BRCA2. Pendant les phases S et G2 du cycle cellulaire ou après l’induction de dommages sur l’ADN, la région TR2 n’est pas phosphorylée et peut interagir avec Rad51 en stabilisant le filament présynaptique. Quand les cellules s’approchent de la mitose, la Ser3291 est phosphorylée et la Recombinaison Homologue est régulée négativement.
Activation de la Recombinaison Homologue Désactivation de la Recombinaison Homologue Phosphorylation de la Ser3291 Déphosphorylation de la Ser3291 TR2 Rad51
Stabilisation du filament présynaptique
TR2 P
Rad51
Déstabilisation du filament présynaptique Activation de la Recombinaison Homologue Désactivation de la Recombinaison Homologue Phosphorylation de la Ser3291 Déphosphorylation de la Ser3291 Activation de la Recombinaison Homologue Désactivation de la Recombinaison Homologue Activation de la Recombinaison Homologue Désactivation de la Recombinaison Homologue Phosphorylation de la Ser3291 Déphosphorylation de la Ser3291 TR2 Rad51
Stabilisation du filament présynaptique
TR2 P
Rad51
Déstabilisation du filament présynaptique
TR2 Rad51
Stabilisation du filament présynaptique
TR2 Rad51
TR2 Rad51
Stabilisation du filament présynaptique Stabilisation du filament présynaptique
TR2 P
Rad51
Déstabilisation du filament présynaptique TR2 P Rad51 TR2 P P Rad51
Déstabilisation du filament présynaptique Déstabilisation du filament présynaptique
Figure 14. Stabilisation du filament présynaptique par l’extrémité C-terminale de BRCA2. Pendant les phases S et G2 du cycle cellulaire ou après l’induction de dommages sur l’ADN, la région TR2 n’est pas phosphorylée et peut interagir avec Rad51 en stabilisant le filament présynaptique. Quand les cellules s’approchent de la mitose, la Ser3291 est phosphorylée et la Recombinaison Homologue est régulée négativement.
Des études structurales et biochimiques réalisées avec la protéine BRCA2 de la souris, ont permis d’examiner un autre domaine présent à l’extrémité C-terminale, le domaine de liaison
à l’ADN (217). Ce domaine comprend cinq sous-domaines dont trois domaines de liaison d’oligosaccharides (domaines OB1, OB2 et OB3) ; ces domaines OB forment des structures caractéristiques qu’on retrouve dans les protéines capables de lier l’ADN simple-brin, comme par exemple RPA. A travers OB1 et OB2, BRCA2 interagit avec une petite protéine de 70 kDa hautement acide, Dss1 (voir ci-dessous). Le complexe formé par BRCA2 et Dss1 peut lier l’ADN simple-brin mais pas le double-brin.
Des données biochimiques ont montré que BRCA2 interagit aussi avec RPA et que le site de liaison à cette protéine se trouve dans l’extrémité N-terminale de BRCA2 ; une mutation dans cette région, Y42C, qui a été retrouvé dans certains cancers, diminue ou élimine l’interaction avec RPA (218).
Figure 15. BRCA2 et son rôle de médiateur de la Recombinaison Homologue. Dans ce modèle, les motifs BRC lient les monomères et la région TR2 lie les anneaux de Rad51. Les motifs BRC et la région TR2 coopèrent pour assembler le filament présynaptique et déplacer RPA de l’ADN simple-brin. (D’après San Filippo J et al., 2008).
RPA
BRCA2
Rad51 TR2-Rad51
BRC-Rad51
Figure 15. BRCA2 et son rôle de médiateur de la Recombinaison Homologue. Dans ce modèle, les motifs BRC lient les monomères et la région TR2 lie les anneaux de Rad51. Les motifs BRC et la région TR2 coopèrent pour assembler le filament présynaptique et déplacer RPA de l’ADN simple-brin. (D’après San Filippo J et al., 2008).
RPA BRCA2 Rad51 TR2-Rad51 BRC-Rad51 RPA BRCA2 Rad51 RPA RPA BRCA2 BRCA2 Rad51 Rad51 TR2-Rad51 BRC-Rad51 TR2-Rad51 BRC-Rad51
Rôle de BRCA2 dans la recombinaison méiotique.
Le rôle de BRCA2 dans la recombinaison méiotique a été identifié pour la première fois dans les eucaryotes unicellulaires. Ce rôle dans les cellules de mammifères a été beaucoup plus difficile à étudier en raison de la mortalité embryonnaire associée à une quelconque mutation qui inactive le gène BRCA2 (202).
Toutefois, des indications sur son implication dans la méiose dérivent de l’observation que BRCA2 est hautement exprimée pendant la spermatogénèse dans la souris (219) et elle se localise aux chromosomes méiotiques pendant la prophase I précoce, quand les chromosomes homologues sont en synapse (139).
Son implication dans la méiose a été confirmée par les études réalisées sur des souris invalidées de BRCA2, maintenues en vie grâce à la transfection d’un chromosome bactérien artificiel exprimant l’équivalent humain de la protéine ; la transfection déterminait une expression basse de BRCA2 dans les gonades et les souris étaient infertiles puisque leurs spermatocytes ne progressaient pas dans la prophase I. Dans ces souris, les CDBs provoquées par Spo-11 se formaient normalement mais ne pouvaient pas être réparées (220). De façon intéressante, ni Rad51 ni Dmc1 n’étaient capables de former des foyers sur les chromosomes méiotiques, ce qui indique que BRCA2 est indispensable pour la localisation à la CDB des deux protéines.
Le site de liaison de Dmc1 sur BRCA2 a été récemment identifié (221), grâce à une combinaison de méthodes (système du double-hybride dans la levure, essais de pull-down avec des protéines marquées et peptide-array) ; cette étude a identifié un motif, appelé PhePP, qui est très spécifique, hautement conservé chez les vertébrés et qui se trouve loin du site d’interaction avec Rad51 (Figure 13). Dans la même étude, il a été aussi montré que Dmc1 humaine peut interagir avec la région TR2 mais la liaison est faible et indépendante de la phosphorylation de la Ser3291. Cela peut indiquer que cette interaction est biologiquement moins importante de l’interaction entre BRCA2 et Rad51.
Néanmoins, l’observation que les deux recombinases ne se lient pas au même site sur BRCA2, reste très intéressante et peut suggérer qu’elles peuvent se lier simultanément et être ainsi adressées au chromosome méiotique après induction de la CDB par Spo-11.
Ces récentes données relatives à l’identification d’un site de liaison spécifique pour Dmc1, suggèrent que si des mutations dans BRCA2 peuvent être à l’origine de la prédisposition au cancer du sein, elles peuvent aussi être impliquées dans des problèmes de fertilité ; même si une corrélation entre ces deux phénotypes doit encore être démontrée.
Rôle de BRCA2 dans la progression du cycle cellulaire.
Il existe plusieurs études qui ont reliées BRCA2 avec la progression à travers la mitose (222, 223). Il a été montré par exemple que BRCA2 s’associe à une protéine qui lie l’ADN, BRAF35 (BRCA2 Associated Factor, 35 kDa), par certains motifs BRC ; BRAF35 interagit avec des structures d’ADN à simple-brin ce qui l’implique dans la réparation par recombinaison. De plus, les deux protéines colocalisent au niveau des chromosomes mitotiques.
Encore, BRCA2 interagit avec BUBR1 (Budding Uninhibited by Benzimidazoles R1 protein), une protéine importante pour l’attachement correct des chromosomes au fuseau mitotique, ce qui impliquerait BRCA2 dans le checkpoint de la phase M. Dans son interaction, BUBR1 phosphoryle BRCA2 à l’extrémité C-terminale, mais cette activité n’a pas encore été corrélée à un rôle biologique de BRCA2.
De façon intéressante, en 1997 des souris homozygotes pour une mutation dans BRCA2 ont été générées ; elles survivent jusqu’au stade adulte même si ces animaux présentent une petite taille, une différentiation des tissus incorrecte, une absence des lignées germinales et un développement de lymphomes létaux (224). Les cellules MEFs dérivés des ces animaux sont viables, mais montrent un défaut de prolifération qui peut être dû à une surexpression de p53 et de p21Waf1/CIP1 ; de plus, ils montrent une diminution dans la réparation des CDBs et une augmentation des aberrations chromosomiques.
Des études utilisant ces fibroblastes, focalisées sur la corrélation entre réparation de l’ADN et développement des cancers, ont montré que ces cellules forment fréquemment des micronoyaux, c'est-à-dire des structures anormales contenant de l’ADN ; la formation des ces micronoyaux dérive de la perte de fragments de chromosomes acentriques et d’une ségrégation incorrecte des chromosomes, et génère l’aneuploïdie. De plus, ces cellules montrent une amplification des centrosomes qui a aussi été associée à la formation des micronoyaux (225). Cette étude suggère l’existence d’un mécanisme selon lequel, l’absence de BRCA2 détermine la perte de la régulation des gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire, et de cette façon permet la prolifération et la cancérogenèse.
La protéine Dss1.
Dss1 est une protéine hautement conservée qui interagit avec l’extrémité C-terminale de BRCA2 (226). Elle se lie à l’intérieur du domaine de liaison de l’ADN simple-brin. L’importance de cette protéine pour la fonctionnalité de BRCA2 a été établie dans le
champignon Ustilago maydis ; quelques unes des ses caractéristiques ont été établies aussi dans des cellules de mammifères (227).
Des expériences réalisées par ARN interférence (RNAi) dans des cellules murines et humaines, ont montré que Dss1 est probablement nécessaire à la formation de foyers de Rad51. Toutefois, Dss1 n’est pas indispensable pour l’interaction entre BRCA2 et Rad51. Probablement Dss1 est indispensable pour la stabilité de BRCA2 ; en effet, une réduction de la concentration de Dss1 réduit aussi la concentration de BRCA2 (228).
Cette protéine pourrait représenter la corrélation entre la réparation de l’ADN et l’activité du protéasome, puisque récemment elle a été identifiée comme un composant du complexe 19S dans la levure (229). Ce complexe sert à reconnaître les protéines ubiquitinées et à les transporter au niveau du complexe protéolytique (230). De plus, des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ont montré la présence de Dss1 au niveau de la CDB, avec les composants 19S et 20S du protéasome.
D’ailleurs il faut remarquer que les doubles mutants, dans une sous-unité du protéasome et dans un gène impliqué dans la HR, sont caractérisés par des défauts dans la croissance cellulaire et par une hypersensibilité à des agents comme l’hydroxyurea (HU) et le MMS.
La protéine PALB2.
Cette protéine a été récemment identifiée dans l’équipe de B. Xia, comme protéine interagissant avec BRCA2 (231). PALB2 contrôle la localisation de BRCA2 et maintient sa stabilité au niveau de la chromatine ; elle semble être critique pour les fonctions de BRCA2 corrélées à la réparation de l’ADN et à l’activation du checkpoint. Le domaine d’interaction avec PALB2 dans BRCA2, a été identifié à l’extrémité N-terminale et la mutation Y42C, qui influence l’interaction entre BRCA2 et RPA, semble empêcher aussi la liaison à PALB2. PALB2 possède une série de domaines WD40 à son extrémité C-terminale qui sont indispensables pour la formation d’un complexe avec BRCA2 et pour la fonction biologique de PALB2.
Des mutations dans le gène codant PALB2 sont associées avec le développement du cancer du sein familial et l’inactivation des deux allèles de PALB2 peut causer l’Anémia de Fanconi du groupe de complémentation N (232, 233). En raison de sa connexion à la FA, PALB2 est aussi connue comme FANCN.