Les deux dernières décennies en recherche biomédicale ont été dédiées à la génomique, puis à la protéomique. Une part importante de ces efforts comprenait l’identification cellulaire et le mode d’expression de GPCR. Étant donné que cette approche est cruciale dans la compréhension du rôle physiologique d’un récepteur, nous l’avons adoptée pour le B1R. Notez que nos travaux reposent sur des données déjà obtenus par PCR (expression de l’ARNm), l’hybridation in situ (localisation de l’ARNm), et par autoradiographie quantitative (localisation des sites de liaison). L’autoradiographie permet la visualisation des récepteurs dans le tissu, mais ne possède pas la résolution suffisante pour identifier le type cellulaire porteur du B1R.
Les premières mesures d’expression du B1R sont celles de Marin-Castano et collaborateurs (Marin-Castano et al., 1998) qui ont démontré une induction significative de l’ARNm du B1R dans différents segments du néphron de rat après traitement au lipopolysaccharide bactérien (18h), par opposition à l’absence d’ARNm chez les rats témoins. Le premier rapport portant sur l’expression du B1R dans les tissus nerveux est celui de Mahabeer (Mahabeer et al., 2000) qui démontra, par hybridation in situ, une expression basale du B1R dans certaines régions de l’hypothalamus, du thalamus, du plexus choroïde, ainsi que dans la moelle épinière chez l’humain. Notez qu’aucune analyse pathologique des sujets n’est fournie. En 2004, les premières données en hybridation in situ et en autoradiographie quantitative ont démontré que l’ARNm et les sites de liaison spécifiques du B1R sont surexprimés
dans la moelle épinière de rats STZ comparativement aux animaux témoins (Ongali et al., 2004). Les premières données utilisant un anticorps dirigé contre la forme humaine du B1R (Raidoo et al., 1997) montrèrent que le B1R est présent sur les cellules endothéliales, ainsi que sur les cellules musculaires lisses vasculaires des larges artères élastiques de patients présentant des plaques athérosclérotiques (Raidoo et al., 1997). Le B1R fut également localisé sur les macrophages spumeux formant la plaque athérosclérotique de ces patients (Raidoo et al., 1997). Finalement, les premières données d’immunolocalisation du B1R dans les tissus nerveux de rats suggèrent une expression basale du B1R dans les ganglions de la racine dorsale (DRG) d’animaux témoins (Ma et al., 2000). Ces données demeurent cependant controversées. En effet, certaines équipes ne parviennent pas à mesurer l’ARNm du B1R chez les animaux témoins (Marin-Castano et al., 1998). De plus, l’administration intraspinale d’un agoniste sélectif du B1R chez ces animaux n’a aucun effet physiologique (Cloutier et al., 2000).
L’absence d’un anticorps commercial spécifique dirigé contre le B1R a grandement limité l’avancée des travaux d’immunolocalisation. Pour pallier ce manque, nous avons développé une méthode novatrice permettant la localisation cellulaire du B1R (Talbot et al., 2009). Celle-ci élimine les principaux problèmes associés aux techniques disponibles puisqu’elle possède une haute résolution (vs autoradiographie) et une haute spécificité (vs anticorps commerciaux). En effet, le couplage d’une molécule fluorescente, le Nα-Bodipy, à l’agoniste sélectif du B1R, la des-Arg9-BK,
nous a permis de générer un puissant outil permettant de révéler le ou les types cellulaires exprimant le B1R et ce, dans le tissu et la pathologie à l’étude.
Cet outil a confirmé que le B1R est absent dans la moelle épinière de rats témoins (Talbot et al., 2009), apportant un nouvel argument contrastant avec les données de Ma (Ma et al., 2000). Aussi, nous avons révélé que le B1R est localisé sur les fibres sensorielles de type C, les astrocytes et les cellules de la microglie des rats pré-traités à la STZ (Talbot et al., 2009). D’ailleurs, nous avons pu confirmer ces données en démontrant que le B1R est présent sur les cellules de la microglie dans deux autres modèles de douleur chronique, soit le rat ayant subi une ligature partielle du nerf sciatique (données non publiées) et le rat traité à la capsaïcine (Talbot et al., 2012). L’importance de cette découverte a été d’ailleurs soulignée dans les articles 2 et 3 de cette thèse où nous avons pu démontrer que la microglie activée est essentielle à l’activité pro-nociceptive du B1R.
La présence du B1R sur les cellules de la microglie reste d’ailleurs à confirmer dans un modèle non-inflammatoire de diabète de type 1 (voir critique modèle STZ), ainsi que dans le diabète de type 2. Aussi, la présence du B1R sur les cellules de la microglie pourrait être investiguée dans d’autres pathologies présentant une surexpression du B1R au niveau cérébral. Entre autres, on peut penser au rat épileptique (modèle «kindled») dont l’induction du B1R fut démontrée par autoradiographie quantitative dans l’hippocampe (CA1, CA2, CA3) et dans le cortex cérébral (Ongali et al., 2003). Notez que la durée et l’intensité des crises épileptiques
induites par l’administration de pilocarpine sont réduites chez les rats B1R-/- (Silva et al., 2008). De plus, il semble que le blocage de l’activation de la microglie par la minocycline permet de contrecarrer l’effet épileptogénique des premières convulsions (Abraham et al., 2012). Ainsi, il est permis de croire que l’effet pro-épileptigène du B1R puisse être relayé par l’entremise des cellules de la microglie, d’où l’intérêt d’investiguer le ou les types cellulaires exprimant le B1R dans différents modèles d’épilepsie chez le rat.
Notez que le Dr Karim Lahjouji (laboratoire du Dr Réjean Couture) a développé en 2009 deux anticorps dirigés contre le B1R du rat et de l’homme. Nous avons d’ailleurs caractérisé ceux-ci dans deux récentes publications (Lin et al., 2010; Talbot et al., 2011a). Ainsi, ces deux anticorps remplissent les critères de spécificité et de résolution nécessaires à leur utilisation en immunohistochimie. Leur utilisation en immunobuvardage de type Western révèle un marquage spécifique, soit une seule bande, en présence d’extraits protéiques de poumons de rats traités avec un condensat de fumée de cigarette (connu pour déclencher l’induction du B1R) (Lin et al., 2010). De plus, aucune bande n’est détectée lorsque ces tissus sont exposés au sérum pré- immun du B1R. Cette bande est aussi absente lorsque l’anticorps est co-exposé avec l’anti-peptide (Lin et al., 2010) ou encore en présence d’extraits protéiques de rats témoins ou de souris B1R-/- (données non publiées). Fait intéressant, nous avons comparé les marquages obtenus au moyen du peptide fluorescent et de l’anticorps spécifique sur des tranches de poumons de rats exposés à des condensats de fumée de cigarette. Les deux approches ont montré que le B1R est localisé sur les cellules
épithéliales alvéolaires de types 1 et 2 ainsi que sur les neutrophiles infiltrant (données non publiées).
En terminant, le nouvel anticorps spécifique présente certains avantages techniques sur le peptide fluorescent. En effet, l’utilisation de ce dernier est limité aux coupes de tissus non-fixées. Cela a pour effet de réduire la qualité des images (résolution) prises en microscopie confocale. En effet, l’intégrité du tissu est affectée par la procédure de congélation, la coupe ainsi que par les premières étapes du protocole d’immunolocalisation. D’ailleurs, cela nous a empêché d’utiliser l’agoniste fluorescent pour procéder à l’immunolocalisation du B1R dans la rétine de rats diabétiques (STZ) ainsi que dans l’aorte d’animaux diabétiques et hypertendus (SHR ou infusés à l’angiotensine II). Ainsi, ce nouvel anticorps spécifique pourrait permettre de revisiter ces questions. En outre, il permet de faire de l’immunohistochimie sur des tissus déjà fixés et archivés dans les banques de tissus humains (ex. : banques de cerveaux ou de rétines de patients diabétiques).