C. DISCUSSION
2. Limites de l’étude
a) Absence de comparaison avec un marqueur génétique
Notre travail a permis d’étudier trois marqueurs fluorescents et de les comparer entre eux. Le cmDiI et le BrdU apparaissent comme les deux plus fiables pour suivre le devenir des cellules. Cependant les différents tests effectués ont été de courte durée et ces marqueurs pourraient poser des problèmes de dilution avec le temps et être moins performants.
Afin d’évaluer de manière plus précise la fiabilité de ces marqueurs il faudrait les comparer à des marqueurs génétiques (Beta-Gal, GFP, luciférase) qui sont transmis à toutes les générations cellulaires et pas aux cellules environnantes.
Une telle comparaison n’a pas pu être effectuée en raison des coûts engendrés et des contraintes techniques.
Le marquage génétique reste à l’heure actuelle la méthode la plus fiable pour suivre le devenir des cellules sur de longues périodes.
b) Taille des échantillons, nombre de mesures
Notre étude a été réalisée sur un petit nombre d’animaux et n’a pas permis de réaliser des groupes d’animaux homogènes ni de réaliser une étude statistique.
Nos résultats sont donc basés sur un faible effectif et sur une courte durée. Il est difficile dans ces conditions de tirer des conclusions sur le comportement à plus long terme des marqueurs.
CONCLUSION
La thérapie cellulaire s’inscrit dans une logique d’évolution de l’arsenal thérapeutique de nombreuses pathologies telles que l’insuffisance cardiaque, l’insuffisance rénale, les maladies nerveuses dégénératives... Elle cherche ainsi à apporter des solutions simples et largement applicables dans des domaines de plus en plus coûteux.
Les enjeux médicaux et financiers de ce type de recherche sont colossaux et de nombreuses questions sont posées : quel type cellulaire greffer selon la pathologie en cause? Comment optimiser la survie des cellules greffées ? Par quels mécanismes les cellules injectées s’intègrent-elles dans l’organe receveur ? Quels sont les effets thérapeutiques résultant de cette intégration ?
La réponse à toutes ces questions passent entre autres au départ par une identification fiable des cellules greffées. De nombreux marqueurs cellulaires existent sur le marché mais tous ne possèdent pas les mêmes qualités.
Notre étude a permis de mettre en évidence la grande facilité d’utilisation et de détection des trois marqueurs biochimiques étudiés, qualité appréciable pour les protocoles de recherche. Cependant aucun des marqueurs étudiés ne réunit toutes les qualités du marqueur idéal, et le choix du marqueur le plus approprié est fonction de l’étude menée. Le DAPI par exemple peut convenir pour des études à très court terme avec un faible risque de mort cellulaire. L’utilisation du BrdU quant à elle impose que les cellules étudiées se multiplient afin de pouvoir incorporer le marqueur. L’utilisation des gènes rapporteurs permet de mieux répondre au cahier des charges d’un marqueur idéal mais pose toujours des problèmes de coût, de technicité et d’immunogénicité.
Une méthode de marquage simple, facilement reproductible, peu onéreuse et fiable reste encore à développer.
ANNEXE I
GLOSSAIRE
• Greffe autologue = autogreffe
Les cellules greffées sont prélevées sur l’organisme receveur (exemple : greffe de cellules myocardiques de brebis dans le myocarde de cette même brebis).
• Greffe homologue = allogreffe
Donneur et receveur appartiennent à la même espèce (exemple : greffe de cellules musculaires d’une brebis A dans le myocarde d’une brebis B, les cellules greffées sont donc génétiquement différentes des cellules du receveur).
• Greffe hétérologue = xénogreffe
Donneur et receveur appartiennent à des espèces différentes (exemple : greffe de cellules de souris à un rat).
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COMPARAISON DE DIFFERENTS MARQUEURS BIOCHIMIQUES POUR LA THERAPIE CELLULAIRE : ETUDE EXPERIMENTALE
NOM et Prénom : PASQUIER Aurélie
RESUME :
Le développement de la thérapie cellulaire s’inscrit dans une logique d’évolution de l’arsenal thérapeutique face à des pathologies aussi diverses que l’insuffisance cardiaque, l’insuffisance rénale... Celles-ci constituent un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Le marquage cellulaire représente un des points clefs de la progression des recherches et de nombreux marqueurs cellulaires sont présents sur le marché. Cependant, le marqueur cellulaire idéal en terme de fiabilité, de simplicité d’utilisation et de coût n’est pas encore disponible.
Notre projet concernait la comparaison in vitro et in vivo de trois marqueurs biochimiques : le DAPI marqueur fluorescent nucléaire, le cmDiI marqueur
fluorescent membranaire et le BrdU marqueur de l’ADN révélé par
immunohistochimie. Au cours des tests que nous avons pratiqués, soit in vitro, soit in vivo (greffe de cellules dans le myocarde chez la brebis et dans l’urètre chez la
chienne), nous avons principalement étudié les propriétés de recaptage et de dilution de ces marqueurs afin de vérifier leur conformité au cahier des charges pré-établi.
Le DAPI s’est révélé être un mauvais marqueur cellulaire en terme de
recaptage, son utilisation ne permet donc pas de suivre avec fiabilité le devenir des cellules greffées. Comparativement le cmDiI et le BrdU se sont révélés être des marqueurs plus fiables.
Cependant, seul le marquage génétique permet de repérer et de suivre sans ambiguïté les cellules greffées.
Mots-clés : Thérapie cellulaire, marqueur cellulaire, DAPI, cmDiI, BrdU, marqueur génétique.
COMPARISON OF DIFFERENT BIOCHEMICAL TRACERS FOR CELLULAR THERAPY: EXPERIMENTAL STUDY
NAME and Surname: PASQUIER Aurélie
SUMMARY:
The development of cellular therapy is in line with the logic of evolution of the therapeutic arsenal, faced with several severe conditions such as heart failure and renal failure, which are major health care issues in developed countries. Cell labelling is a crucial aspect of pre-clinical research for cellular therapy. Many different cell labelling techniques are available on the market. However, as regards reliability, ease of use and cost, the ideal cell tracker is not yet available.
Our project deals with the in vitro and in vivo comparison of three cell trackers: DAPI, nuclear fluorescent tracker, cmDiI, membrane fluorescent tracker, BrdU, tracker revealed by immunohistochemistry. During our tests, either in vitro or in vivo (cellular transplantation in sheep’s myocardium and in dog’s urethra) we have mainly studied the re-uptake and dilution properties of the trackers in order to check their accordance with the specifications that we had previously established.
We conclude that re-uptake of DAPI disqualifies the use of this reagent for accurate tracking of implanted cells. By comparison cmDiI and BrdU proved to be more reliable.
We think that only genetic labelling will permit unambiguous identification of the implanted cells and analysis of their fate.
Key words: cellular therapy, cell tracker, DAPI, cmDiI, BrdU, genetic labelling.
JURY:
President: Pr
Director: Pr BERNEX Assessor: Pr POUCHELON Guest : Dr BORENSTEIN Mme HEKMATI
Author’s Address : 89 c les bois du cerf 91450 Etiolles