Autres domaines d’intérêt de la thérapie cellulaire

La thérapie cellulaire intéresse de nombreux autres domaines, que ce soit pour la restauration fonctionnelle des tissus ou pour délivrer des protéines thérapeutiques aux patients.

Des greffes intracérébrales de cellules progénitrices du système nerveux central (SNC) ont été réalisées chez des patients atteints de la maladie de Parkinson pour augmenter leur niveau de dopamine (31, 85) et ralentir l’évolution de la maladie.

La greffe directe de cellules satellites compétentes possédant le gène de la dystrophine constitue une alternative pour le traitement de la myopathie de Duchenne (DMD). Les greffes de cellules satellites chez des animaux modèles de la DMD, ont donné de très bons résultats et ont poussé les cliniciens à tenter des allogreffes chez des garçons malades.

La greffe de cellules satellites compétentes, provenant du père ou du frère du malade dans le muscle d’enfants myopathes, a permis d’obtenir l’expression de dystrophine dans le muscle greffé (63).

Les résultats cliniques sont cependant décevants et de nombreux problèmes restent encore à résoudre, mais il est indéniable que la thérapie cellulaire, par l’intermédiaire de la greffe de myoblastes, représente un outil thérapeutique important dans le traitement des myopathies.

La thérapie cellulaire s’inscrit dans une logique d’évolution de l’arsenal thérapeutique que ce soit pour les maladies cardio-vasculaires, les myopathies, les maladies nerveuses dégénératives… Elle répond à un manque de solutions thérapeutiques simples et largement applicables dans des domaines de plus en plus coûteux.

Les recherches actuelles portent entre autres sur l’identification du meilleur type cellulaire pour chaque greffe, l’optimisation des paramètres de culture cellulaire in vitro, et surtout sur les mécanismes par lesquels les cellules greffées survivent, s’intègrent dans l’organe receveur et apportent un effet thérapeutique. C’est grâce à une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu au sein même de l’organe que l’on pourra améliorer les greffes cellulaires et trouver des outils thérapeutiques largement applicables.

B. Problème de l’identification cellulaire, intérêts des marqueurs cellulaires

1. Pourquoi identifier les cellules : qu’est-ce qu’un marqueur cellulaire ?

Les enjeux de la thérapie cellulaire, dont on a vu quelques exemples, sont de plus en plus importants que ce soit d’un point de vue médical ou financier. La compréhension des mécanismes mis en jeu lors de greffe cellulaire est un des points clefs dans la progression des recherches. Il est indispensable de comprendre comment les cellules survivent et s’intègrent dans l’organe receveur, quelles sont les liaisons mises en place avec les cellules hôtes, quelle est l’influence de l’environnement sur leur phénotype, afin de mesurer l’impact de leur éventuel effet thérapeutique.

Pour comprendre les mécanismes mis en jeu et faire avancer les recherches, il est indispensable de pouvoir identifier les cellules greffées de manière fiable.

Différentes caractéristiques intrinsèques aux cellules peuvent permettre de les identifier sans manipulation:

• Lors de greffe dans un tissu différent du tissu d’origine on peut utiliser les caractéristiques morphologiques des cellules ou la présence d’antigènes spécifiques de tissus pour les identifier (83).

On peut par exemple identifier des hépatocytes greffés dans une rate grâce aux différences morphologiques existant entre ces deux types cellulaires.

Dans le cas d’une greffe de myoblastes dans un myocarde, on peut utiliser la chaîne lourde de la myosine comme marqueur endogène, cet antigène sera présent exclusivement sur les cellules greffées.

Cependant cette technique ne permet pas de repérer des cardiomyocytes greffés dans un myocarde, elle ne permet pas non plus de suivre le destin des cellules si celles-ci changent de phénotype dans leur nouvel environnement, si par exemple les myoblastes greffées dans le myocarde se modifient et ne synthétisent plus de myosine, on ne peut plus les différencier des cellules hôtes.

• Lors d’allogreffe on peut utiliser la diversité allélique des complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) (16, 55).

On peut également utiliser d’autres types de diversité allélique existant entre les individus d’une même espèce.

Les neurones n’expriment pas les antigènes du CMH mais on utilise chez la souris la diversité allélique du gène codant pour la glycoprotéine

Thy-1. Lors de greffe de cellules embryonnaires provenant du SNC d’une souris exprimant l’allèle Thy-1.1 dans le SNC d’une souris exprimant l’allèle Thy-1.2, les cellules greffées sont détectées avec un anticorps spécifique de l’allèle Thy-1.

Cependant les allogreffes nécessitent une immunosuppression du receveur afin d’éviter un rejet des cellules greffées.

• Lors de greffe de cellules mâles dans des organismes femelles on peut détecter une portion spécifique du chromosome Y (16).

On a par exemple greffé un rein de femme à un homme afin d’étudier la colonisation de l’organe greffé par les cellules du receveur (74).

Cette technique nécessite une hybridation in situ pour visualiser les cellules greffées (FISH). Cette étape prend du temps et est difficilement réalisable conjointement à de l’immunohistochimie, technique nécessaire pour déterminer le phénotype cellulaire.

• Lors de xénogreffe il existe des antigènes spécifiques d’espèces (16, 55).

On peut par exemple greffer des cellules de souris dans le SNC de rats, la détection des cellules greffées est réalisable grâce à des anticorps spécifiques de souris.

De la même manière on a greffé des cellules nerveuses humaines dans le SNC de rongeurs afin d’évaluer la capacité des cellules humaines à se différencier dans le SNC, pour les identifier on utilise des anticorps spécifique de l’espèce humaine.

Cependant de telles greffes sont problématiques car elles requièrent une immunosuppression de l’hôte ou l’utilisation d’animaux immunosupprimés d’un coût élevé et dont la manipulation reste délicate.

• Lors de l’utilisation d’animaux transgéniques comme donneurs, on peut identifier les cellules greffées grâce à l’expression d’une protéine spécifique (16, 83).

La myopathie de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X qui touche 1/3500 garçons à la naissance. Elle est due à une mutation touchant le gène de la dystrophine. L’absence de cette protéine chez les malades fragilise les fibres musculaires qui dégénèrent au cours des contractions.

Des lignées de chiens myopathes ont été créées pour l’étude de cette maladie. Lors de greffe de myoblastes provenant de chiens sains sur des chiens myopathes, on peut repérer les cellules greffées car celles-ci synthétisent de la dystrophine (62).

La création d’animaux transgéniques est toutefois coûteuse et nécessitent un savoir faire particulier.

L’utilisation de caractéristiques intrinsèques aux cellules greffées pour les identifier chez l’hôte et suivre leur devenir a des limites : certaines techniques ne

sont pas infaillibles, nécessitent une immunosuppression du receveur, un savoir faire particulier ou sont très coûteuses.

Le recours à des marqueurs cellulaires incorporés aux cellules apparaît donc indispensable dans le cadre de la thérapie cellulaire. Les cellules injectées étant des cellules souches, les marqueurs utilisés doivent permettre un suivi à long terme de ces cellules afin de déterminer leur devenir et notamment leur participation à la régénération et à la reconstitution à long terme d’épithéliums, de tissus…

Nous qualifierons ici de marqueur cellulaire une molécule exogène utilisée pour suivre le devenir des cellules marquées.

2. Comment identifier les cellules : quelles sont les qualités requises pour être un bon marqueur cellulaire ?

Il existe de nombreux marqueurs cellulaires, tous présentent des avantages et des inconvénients (67).

Le choix du marqueur le plus approprié dépend du type cellulaire étudié, de la période pendant laquelle on a besoin de suivre les cellules greffées (16), des capacités techniques et du budget disponible.

Cependant on peut tout de même souligner les principales caractéristiques nécessaires à un marqueur afin d’assurer un suivi fiable des cellules greffées et réaliser un cahier des charges du marqueur idéal.

Un bon marqueur semble être :

• Persistant dans la cellule

• Détectable aisément

• Sans influence sur le métabolisme et la physiologie cellulaires

• Non toxique aux concentrations usuelles

• Non recapté par les cellules environnantes

• Facile d’utilisation (technique de marquage)

• Peu cher

C. Applications possibles des marqueurs cellulaires

1. Utilisation de ces marqueurs a) Etude des divisions cellulaires

La connaissance du cycle cellulaire et des mécanismes régissant la synthèse d’ADN ont constitué une étape importante en biologie cellulaire et moléculaire. Les premières études ont utilisé des marqueurs radioactifs, comme la thymidine tritiée dont l’incorporation à l’ADN cellulaire est détectée par autoradiographie.

Actuellement d’autres marqueurs dont l’utilisation est plus simple sont utilisés, comme le BrdU qui s’incorpore dans l’ADN à la place de la thymidine et qui est révélé par immunohistochimie (38).

Les marqueurs cellulaires ont également permis l’étude de la prolifération de différentes populations cellulaires comme les lymphocytes ainsi que leur différenciation en clones cellulaires spécifiques d’antigènes.

b) Suivi de la migration et de la différentiation cellulaire

Les lymphocytes constituent le support de l’immunité, ils ont la capacité de pouvoir migrer continuellement dans le corps et selon leurs propriétés, ils se positionnent dans des zones spécifiques des organes lymphoïdes. Suite à une stimulation antigénique, on assiste à une prolifération rapide des clones cellulaires de lymphocytes B et de lymphocytes T spécifiques de l’antigène et à une migration des cellules formées.

L’utilisation de marqueurs cellulaires a permis de suivre les migrations lymphocytaires, ainsi que leur position dans les différents tissus et leur prolifération.

Cela représente une aide considérable pour l’analyse de la physiologie de la circulation de ces cellules.

En 1999, PARISH (71) présente une étude comparative de quatorze marqueurs fluorescents utilisés depuis les vingt dernières années pour suivre la migration lymphocytaire. Cette étude a permis de classer ces marqueurs en fonction de différentes caractéristiques : facilité de détection, temps pendant lequel le suivi est possible, capacité de marquer différemment certaines sous populations lymphocytaires…

Différentes études ont ainsi pu démontrer que la remise en circulation des lymphocytes est influencée par leur origine anatomique (15), la présence d’une inflammation (22, 43) ou de cytokines pro inflammatoires (26, 45).

c) Rôles actuels dans la thérapie cellulaire (1)Transplantation hépatocellulaire

Lorsque l’on greffe des hépatocytes dans du parenchyme hépatique, les cellules greffées ont une apparence morphologique ne permettant pas de les différencier des hépatocytes de l’hôte par les techniques histologiques conventionnelles (hématoxyline, éosine). Ceci a représenté un facteur limitant dans de nombreuses études.

L’utilisation de marqueurs spécifiques et fiables a permis par la suite un suivi aisé et sans équivoque des cellules greffées.

Ainsi certaines études ont pu démontrer que la transplantation hépatocellulaire permet d’améliorer des déficits hépatiques chez l’animal de laboratoire, par exemple amélioration d’une hyperbilirubinémie secondaire à un déficit en UDP-glycuronyltransférase chez un rat « Gunn » ou encore d’une hypercholestérolémie due à un déficit en récepteurs LDL chez un lapin « Watanabe » (83).

L’utilisation de marqueurs cellulaires a permis de faire avancer les recherches sur la transplantation hépatocellulaire en tant que thérapie pour les maladies génétiques ou acquises chez des modèles expérimentaux.

Cependant les résultats de recherches plus récentes semblent moins prometteurs qu’attendu. La thérapie cellulaire appliquée à l’insuffisance hépatique n’est toujours pas considérée comme une thérapeutique efficace pour de nombreux patients.

(2)Transplantation de cellules souches nerveuses dans le système nerveux central

Les cellules nerveuses souches ont un potentiel thérapeutique illimité pour restaurer les fonctions du SNC perdues suite à un traumatisme ou à une maladie dégénérative (16). La transplantation de cellules souches du SNC apparaît donc intéressante en tant que thérapie potentielle lors de déficits fonctionnels (67).

L’utilisation thérapeutique de ces cellules implique qu’elles se différencient dans le SNC de l’hôte, il faut donc pouvoir démontrer sans ambiguïté si les cellules greffées survivent et si elles se modifient selon leurs fonctions futures (16).

Certaines études ont mis en évidence une amélioration clinique suite à la transplantation, mais les mécanismes mis en jeu demeurent inconnus. Afin de

comprendre comment un effet bénéfique peut se produire, l’identification des cellules greffées est indispensable (67).

Le marquage de ces cellules est donc un élément essentiel des recherches.

En 1993, ONIFER et al. (67) ont marqué des cellules nerveuses in vitro et in vivo avec différents marqueurs fluorescents. Les résultats de cette étude montrent l’importance d’utiliser des marqueurs parfaitement adapté à la population cellulaire greffée, pour cela les marqueurs envisagés doivent être testés in vitro puis in vivo avant d’interpréter les résultats.

(3)Transplantation de cellules musculaires ou de cellules souches dans le myocarde

Le but de la thérapie cellulaire dans le cadre de l’insuffisance cardiaque est de remplacer les cardiomyocytes lésés afin d’améliorer la fonction contractile des ventricules notamment.

A l’inverse du tissu myocardique, le tissu musculaire strié squelettique présente de fortes potentialités de régénération, grâce à la présence de cellules souches : les cellules satellites. Les cellules satellites sont des cellules myogéniques mononuclées issues des myoblastes embryonnaires. Elles sont accolées à la fibre musculaire striée, sous la lame basale et l’endomysium. Quiescentes à l’état normal chez l’adulte, elles peuvent être réactivées par des lésions chimiques, mécaniques ou par une dissociation enzymatique. Elles représentent 20 % des noyaux musculaires chez le fœtus et 1 à 2 % chez l’adulte (38, 42). Leurs capacités de prolifération, leur origine embryonnaire mésodermique commune avec les cardiomyocytes ainsi que leur accessibilité dans tous les muscles squelettiques, en font des cellules particulièrement étudiées pour la transplantation cellulaire dans le myocarde. Elles sont, en outre, très résistantes à l’ischémie.

De nombreuses équipes de chercheurs ont greffé des myoblastes squelettiques au sein du myocarde. Les résultats de ce type de greffes dans le cœur de chiens, de rats, ou de lapins ont montré clairement la survie et la différentiation des cellules greffées. De plus, il a été démontré une amélioration des performances hémodynamiques du cœur ainsi greffé (87).

La majorité des recherches dans ce domaine concerne la réparation de lésions myocardiques localisées, de type infarctus. Mais de bons résultats ont aussi pu être obtenus par la greffe intra myocardique de myoblastes autologues dans le cœur de chiens atteints de cardiomyopathie dilatée idiopathique : amélioration de l’état clinique de chiens greffés et amélioration des performances hémodynamiques (fraction de raccourcissement, volume systolique) (12).

BORENSTEIN et al. (11) ont montré très récemment que la greffe de myoblastes non cultivés, directement après leur extraction enzymatique, donne de très bon résultats dans le myocarde de moutons : les analyses histologiques après trois semaines montrent que les cellules musculaires se sont greffées massivement au sein du myocarde. Les études précédentes n’avaient jamais sautées l’étape de la culture cellulaire in vitro préalablement à la greffe. Pourtant, éviter la culture cellulaire permet de gagner du temps et de l’argent, et de réduire les risques de contamination des cellules.

Afin de pouvoir mesurer l’impact des greffes cellulaires sur la contractilité cardiaque, il est nécessaire de prouver que les cellules ont survécu à la transplantation et qu’elles se sont intégrées dans l’architecture du myocarde. Le recours aux marqueurs cellulaires est en cela indispensable.

(4)Transplantation de myoblastes dans l’urètre : urétromyoplastie cellulaire

Les premières greffes de myoblastes dans l’urètre (précurseurs embryonnaires des cellules musculaires striées) sont très récentes. Cette nouvelle stratégie pour le traitement de l’incontinence urinaire pourrait avoir un intérêt clinique direct, en améliorant les résultats des traitements endoscopiques classiques de l’incontinence urinaire à l’effort de la femme (injection de collagène, graisse, téflon).

Les myoblastes récoltés par simple aspiration dans le muscle du bras d’une patiente pourraient, après une mise en culture de quelques jours, lui être réinjectés au sein de l’urètre à l’aide d’un endoscope, sous anesthésie locale (38).

En 2000, l’équipe de CHANCELLOR (21) a publié les résultats de la greffe de myoblastes provenant d’une lignée cellulaire immortelle de souris, dans les parois urétrales et vésicales de rattes. Les myoblastes ont été mis en culture avec des adénovirus qui leur ont transmis le gène rapporteur de la β-galactosidase, et avec des microsphères de latex fluorescentes. Ainsi, le devenir des myoblastes après la greffe a pu être suivi à l’aide de deux marquages différents. Les urètres ont été prélevés trois à quatre jours après la greffe pour éviter le rejet par le système immunitaire. Les analyses histologiques ont révélé la présence de nombreuses cellules exprimant la β-galactosidase et contenant des microsphères fluorescentes dans la paroi vésicale et la paroi urétrale : des myoblastes, mais aussi des myotubes et des fibres musculaires résultant de leur fusion. Cette expérience montre la faisabilité de la greffe de myoblastes dans la paroi urétrale avec la survie et la différenciation des myoblastes injectés ainsi que la formation de myotubes et de fibres musculaires capables de produire la β-galactosidase dans la paroi de l’urètre, sans effet indésirable particulier.

L’équipe de BORENSTEIN a réalisé en 2002 (39) une succession d’essais de faisabilité de greffe de myoblastes sur des urètres de chiennes, avec en parallèle un travail réalisé in vitro et l’observation in vivo du devenir des cellules greffées. Ce travail a permis de mieux connaître les conditions de culture favorables à la multiplication des myoblastes, les marqueurs les plus efficaces sur ce type cellulaire (cmDiI, BrdU), les techniques utilisables pour améliorer la survie des cellules greffées.

(5)Transplantation de cellules souches de la moelle osseuse au sein du tissu rénal

L’insuffisance rénale chronique constitue un problème majeur de santé publique, les thérapeutiques sont peu nombreuses et la dialyse reste le passage obligé en attendant la greffe.

La néphrologie ne s’intéresse que depuis peu au potentiel thérapeutique des cellules souches (CS) (16, 67).

Les premiers résultats chez le petit animal (souris notamment) (42, 74) sont très prometteurs en vue d’une utilisation future chez l’homme et la thérapie cellulaire utilisant les CS de la moelle adulte ouvre une nouvelle voie thérapeutique dans le cadre du traitement de nombreuses pathologies rénales.

En 2001, IMASAWA et al. (42) ont greffé de la moelle osseuse provenant de souris transgéniques pour une protéine fluorescente (GFP), à des souris C37BL/6j irradiées. Le marquage par la GFP a permis de suivre les cellules greffées. Un nombre grandissant de cellules marquées a ainsi été observé parmi les cellules glomérulaires des souris greffées, jusqu’à 24 semaines après la greffe. De plus les cellules marquées ont pu être identifiées comme appartenant au groupe des cellules mésangiales.

En 2001, POULSOM et al. (74) ont étudié le rôle des cellules greffées dans le renouvellement et la régénération du parenchyme rénal en utilisant le chromosome Y comme marqueur du devenir des cellules médullaires. Ils ont injecté des cellules de moelle osseuse provenant de souris mâles dans la circulation sanguine de souris femelles. Les cellules greffées ont été retrouvées dans le rein, essentiellement sous la forme de cellules épithéliales tubulaires mais aussi, en moins grand nombre, sous la forme de cellules podocytaires.

Actuellement des études sont en cours dans l’espèce ovine dans le cadre de la recherche sur le potentiel d’un type particulier de CS, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la moelle osseuse.

En 2003, l’équipe de LABORDE et BEHR (7) a travaillé sur un modèle expérimental ovin adulte d’ischémie-reperfusion rénale. Ils ont mis au point la culture, la sélection et l’amplification des CSM en vue de l’obtention d’un nombre conséquent et suffisant (100 × 10⁶) de cellules pour une greffe autologue par une technique de cathétérisme percutanée dans l’artère rénale. Un double marquage

cellulaire immunohistochimique combinant le BrdU et des marqueurs spécifiques des différentes populations cellulaires rénales (la pancytokératine spécifique des podocytes, la vimentine spécifique des cellules mésangiales et la desmine spécifique des cellules glomérulaires) a permis de déterminer les différenciations cellulaires des CSM greffées. Dans l’ensemble des groupes, témoins ou ischémiés, les cellules se sont différenciées en podocytes au sein des glomérules ou en cellules épithéliales au sein des tubules. Ces résultats montrent la participation des CSM dans la régénération physiologique du rein.

(6)Transplantation de cellules hématopoïétiques comme immunothérapie

La transplantation de cellules hématopoïétiques chez des patients atteints de

La transplantation de cellules hématopoïétiques chez des patients atteints de