Liaison de PCSK9 au VLDLR, à l’ApoER2 et à l’annexine A2

3.6.2.1. VLDLR et ApoER2

Des résultats contradictoires ont été rapportés en ce qui concerne la capacité de PCSK9 d’interagir avec des protéines autres que le LDLR. En effet, Zhang et al. ont montré qu’on ne pouvait détecter de liaison entre PCSK9 et le VLDLR dans les cellules COS-M transfectées, tel que décrit dans la section précédente 73. Par contre, Poirier et al. ont montré que PCSK9 pouvait se lier aux récepteurs ApoER2 et VLDLR et ce, d’une manière indépendante du LDLR et de l’activité catalytique de PCSK9 84. En effet, à l’aide de cellules CHO-A7, déficientes en LDLR endogène et exprimant de façon stable les récepteurs ApoER2 et VLDLR, ces auteurs ont démontré que la présence de ces récepteurs augmentait la capacité d’association de PCSK9 aux cellules, suggérant une liaison directe ou indirecte. Les données de Zhang et al. montrent qu’après 2 heures d’incubation des cellules COS-M avec la PCSK9 exogène, seules les cellules exprimant le LDLR versus le VLDLR liaient la PCSK9. Les travaux de Poirier et al. montrent qu’une incubation pendant 16 heures des cellules CHO-A7 avec la PCSK9 exogène résultait en une association accrue de PCSK9 aux cellules et qu’une co-expression de PCSK9 avec des récepteurs ApoER2 et VLDLR provoquait une augmentation de la dégradation de ceux-ci 84. Il serait donc possible que PCSK9 ait une affinité plus élevée pour le LDLR versus l’ApoER2 et le VLDLR et/ou que ces interactions dépendent du type cellulaire. Après vérification, cette dégradation accrue a pu être observée dans six lignées cellulaires différentes, mais pas dans les cellules COS-1, suggérant que la dégradation observée pourrait dépendre de facteurs

cellulaires spécifiques tels que l’ARH pour le LDLR et Dab1 pour l’ApoER2 et le VLDLR

85_.

Par ailleurs, pour déterminer l’interaction entre PCSK9 et les récepteurs ApoER2 et VLDLR d’une manière plus directe, Shan et al. 86 ont utilisé un essai de liaison acellulaire « Alphascreen » (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay; Perkin-Elmer), capable de déterminer directement l’interaction entre PCSK9-FLAG et un présumé partenaire de liaison. Cette technique requiert que des billes liées à un « donneur » et à un « accepteur » se retrouvent à proximité via une interaction protéine-protéine pour produire une augmentation de luminescence 87. Grâce à cette technique, une liaison dépendante de la concentration entre PCSK9 et les récepteurs LDLR, ApoER2 et le VLDLR de la souris (mVLDLR) a été observée. De plus, ce groupe a démontré qu’un peptide EGF-A pouvait inhiber la dégradation du LDLR par la PCSK9 dans les cellules HepG2. Ce peptide était même capable d’inhiber la liaison de PCSK9 au mVLDLR, tandis que la liaison à l’ApoER2 était moins affectée. Par contre, la protéine associée au LDLR (RAP), qui interagit avec les domaines de répétitions de type A (LA) du LDLR, a inhibé de façon plus efficace la liaison de PCSK9 à l’ApoER2 que la liaison avec le LDLR ou le mVLDLR 86. Ces résultats démontrent que, bien que PCSK9 lie plusieurs récepteurs par l’intermédiaire de leur EGF-A, des contacts supplémentaires avec d’autres domaines de ces récepteurs sont aussi impliqués.

3.6.2.2. Annexine A2

Une étude très intéressante a rapporté pour la première fois la présence d’un inhibiteur endogène de la PCSK9. En effet, par des techniques de « Far Western blotting », de co-immunoprécipitation et de « pull-down », Mayer et al. 88 ont démontré que l’annexine A2 (AnxA2), via son domaine R1, pouvait se lier au domaine CHRD de la PCSK9, prouvant ainsi l’existence d’une nouvelle voie de régulation pour empêcher la dégradation

du LDLR par la PCSK9. L’annexine A2 (AnxA2) est une protéine d’environ 33 kDa qui fait partie de la famille des annexines. Les annexines sont des protéines qui possèdent une double localisation cellulaire cytosolique et membranaire. Elles font le lien entre la signalisation calcique et la dynamique membranaire, deux fonctions impliquant un même mécanisme de base ; leur liaison est réversible et dépendante du Ca2+. L'AnxA2 est structurée en 2 domaines : le cœur qui contient les sites de liaison au Ca2+ responsables de la liaison aux membranes, et le domaine N-terminal qui possède le site de liaison à la protéine S100A10 avec laquelle elle forme un tétramère. En présence du Ca2+, l'AnxA2 se lie aux membranes plasmiques via des phospholipides anioniques tels que la phosphatidylsérine (PS) et le phosphatidylinositol (PI) et provoque aussi l’agrégation de ces membranes. L'AnxA2 est impliquée dans les phénomènes d'exocytose et d’endocytose, de coagulation, d’interactions membrane-cytosquelette (actine) et de formation des jonctions intercellulaires 89.

Il a été démontré que l’AnxA2 soluble pouvait réduire la quantité de PCSK9 sur la surface cellulaire, et qu’une surexpression d’AnxA2 dans les cellules HepG2 provoquait une augmentation du niveau de LDLR sur la surface cellulaire 88. Les résultats obtenus démontrent donc que l’activité de PCSK9 sur le LDLR pourrait être inhibée par la liaison à l’AnxA2. La liaison de PCSK9 à l’AnxA2 pourrait, possiblement, causer des changements structurels allostériques dans le domaine catalytique de PCSK9, affectant ainsi sa capacité à induire la dégradation du LDLR. Cependant, on ne sait pas si le complexe PCSK9/AnxA2 est internalisé dans les endosomes/lysosomes ni si l’interaction CHRD/AnxA2 prévient l’internalisation du complexe PCSK9/LDLR.

L’analyse de l’expression de l’ARNm de l’AnxA2 dans des lignées cellulaires humaines par PCR quantitatif a révélé que l’AnxA2 est exprimée dans la plupart des lignées et surtout dans les cellules épithéliales. Fait intéressant, dans l’intestin et le foie, les niveaux d’ARNm d’AnxA2 et de PCSK9 semblaient être l’inverse l’un de l’autre, PCSK9 étant fortement exprimé dans le foie, mais non l’AnxA2 et l’AnxA2 étant abondante dans le

jéjunum et non la PCSK9. L’AnxA2 est également très abondante sur la surface des cellules endothéliales, incluant celles des poumons, de l’intestin grêle et des surrénales. Ceci pourrait expliquer l’incapacité de PCSK9 à dégrader le LDLR des surrénales, même lorsqu’injecté en grande quantité 90, ainsi que la courte durée de demi-vie de PCSK9, qui n’est due qu’en partie à la présence du LDLR 90. L’incapacité de PCSK9 à détruire le LDLR dans les fibroblastes et les cellules COS-7 73 pourrait également être causée par leur expression élevée d’AnxA2.

Bref, l’identification du domaine R1 de l’AnxA2 qui se lie à la PCSK9 procure un outil potentiel pour réguler la fonction de PCSK9. Des dérivés de ce segment pourraient être utilisés pour inhiber la fonction de PCSK9 sur le LDLR et possiblement ses autres cibles, comme le VLDLR et l’ApoER2.