II.6.1. Détermination de la stoechiométrie de liaison EcNikR:ADN
Afin de déterminer la stoechiométrie de liaison d’EcNikR sur sa boîte pnikA, les complexes ADN/Protéine ont été visualisés par la technique des retards sur gel et le tout a été analysé par la méthode de Ferguson (cf. Matériel & Méthodes). La séquence oligonucléotidique de 46 pb utilisée pour cette étude, comprenant le motif 6-16-6 pb lié par EcNikR, présentait en l’extrémité 5’ une sonde fluorescente, la fluorescéine (notée Fl) pour visualiser l’ADN (Figure II.13). Cette même séquence a été utilisée pour mesurer la liaison à l’ADN de EcNikR WT et Q2E en anisotropie de fluorescence.
Figure II.13 Séquence de 46 pb présentant le motif lié (en gras) par EcNikR sur le promoteur pnikA. Une sonde
fluorescente en 5’ (fluorescéine) a été ajoutée afin de visualiser l’ADN.
La technique des retards sur gel a permis de visualiser trois complexes Protéine:ADN ayant des poids moléculaire apparents de 86, 190 et 224 kDa (Figure II.14). Le poids moléculaire apparent de l’ADN est de 37 kDa (versus 30 kDa théorique). Le complexe de 86 kDa correspondrait à la liaison de 1 tétramère pour 1 ADN (1:1). Ce complexe n’est visualisé qu’à partir de 5 µM de protéine pour un rapport de concentration protéine/ADN de 50.
Ce complexe est observable pour des concentrations croissantes en protéine, mais il est associé à deux autres complexes. Le complexe à 190 kDa correspondrait soit à un complexe 2:1 soit 2:2 et le complexe à 224kDa correspondrait soit à un complexe 3:1 soit 3:2 (complexe Protéine:ADN)
Figure II.14 Retards sur gel visualisés par fluorescence montrant la migration de l’ADN. EcNikR WT (1.25µM
– 30µM) a été incubée avec 100nM de pnikA-Fl en présence de 10µM de Ni(II) et de dIdC à 100 µg/mL. Le gel (à 8%) et le tampon de migration contiennent également du Ni(II) à 10µM. Le poids moléculaire apparent des
uniquement la technique des gels retard par l’équipe de D. Zamble (Bloom & Zamble, 2004). Les conditions appliquées mettaient en présence 50nM d’ADN spécifique (100pb) avec 35µM de Ni(II) et une gamme de protéine allant de 25 nM à 500nM†. La liaison maximale de l’ADN avait été observée pour des rapports Protéine:ADN égaux ou supérieurs à 4.
L’absence de complexe protéine:ADN (rapport 12.5 et 25) en présence d’un excès de métal dans nos conditions n’est pas en accord avec les données de la littérature. En effet a priori l’affinité pour l’ADN serait de 20 pM (Bloom & Zamble, 2004). L’ADN fluorescent devrait être totalement complexé et ce n’est pas le cas.
Cependant si la protéine est amenée à précipiter (cf. ses caractéristiques de métallation), il est possible qu’elle ne puisse plus lier l’ADN spécifique, ou au contraire le lier ainsi que l’ADN compétiteur de façon aléatoire. Une telle hypothèse permettrait d’expliquer l’observation des complexes à 190 et 224 kDa après qu’une saturation de l’ADN compétiteur ait eu lieu.
Le caractère agrégatif Ni-dépendant d’EcNikR semble perturber l’étude de sa liaison à l’ADN.
II.6.2. La liaison à l’ADN suivie par anisotropie de fluorescence
Les liaisons à l’ADN de EcNikR WT et Q2E sur la séquence pnikA-Fl (utilisée en gel retard ci-avant) ont été mesurées par anisotropie de fluorescence dont le principe est brièvement expliqué en Matériel et Méthodes. Lorsque la protéine se lie à l’ADN, cela se traduit par une augmentation de l’anisotropie (r) de la sonde fluorescente (la fluorescéine ici).
La liaison totale d’EcNikR WT et Q2E à pnikA-Fl a été suivie au cours de titrations par le nickel en absence d’ADN compétiteur (Figure II.15). Leur liaison spécifique a également été suivie en présence d’ADN compétiteur (poly dIdC) (Figure II.15).
Figure II.15 Liaison à l’ADN suivie par anisotropie de fluorescence au cours d’une titration par le nickel. 10 nM
de pnikA-Fl, 2.5µM de protéine (WT : ; Q2E : ) sont mis en présence dans un tampon 20 mM MOPS pH7, 150 mM KCl, 12 mM MgSO4, avec ou sans dIdC à 10µg/mL. rmax du système : 0,2.
On peut remarquer que la liaison à l’ADN d’EcNikR WT et Q2E diffère en absence d’ADN compétiteur (rmax WT : 0,2 et rmax Q2E : 0,085) alors qu’elle est similaire en présence d’ADN
compétiteur (rmax : 0,082). EcNikR WT tend à lier significativement l’ADN de façon
aspécifique. Les liaisons non-spécifique et spécifique à l’ADN des protéines sont concomitantes et sont observées dans des conditions d’agrégations. Ces observations sont en accord avec les résultats que nous avons concernant la liaison d’EcNikR à pnikA mesurée par un test de protection à la nucléase (Fauquant et al., 2006).
EcNikR WT tend à s’agréger sur l’ADN spécifique en absence d’ADN compétiteur. Bien qu’EcNikR Q2E ait les mêmes propriétés de métallation et d’agrégation qu’EcNikR WT, elle ne se comporte pas de la même façon face à l’ADN. EcNikR Q2E agrégée ne semble pas se lier à l’ADN.
La liaison spécifique d’EcNikR WT et Q2E sur pnikA débute à partir de 1 équivalent et est maximale à 2,5-3 équivalents de nickel ajoutés par sous unité.
Les conditions expérimentales imposées supposent que le facteur limitant pour la liaison à l’ADN ne soit pas la protéine (excès de 62,5x par rapport à la concentration en ADN) mais plutôt la concentration en nickel. La proportion de protéine activée est dépendante de l’affinité relative de cette dernière pour le métal. 50% de liaison à l’ADN est observable pour 1,5 eq de Ni(II) soit 3,8µM. Si l’affinité du site de haute affinité d’EcNikR pour le Ni(II) était de 7pM, alors plus de 90% de la protéine serait active à 3,8µM, il en serait de même si le Kd était plutôt submicromolaire (Kd~100nM) comme nous le pensons. La liaison à l’ADN devrait également être maximale même en considérant un Kd moyen de liaison à l’ADN de 20nM (Bloom & Zamble, 2004) en présence de 1 comme de 1,5 équivalents de Ni(II).
Cependant cette liaison pouvait être mesurée en conditions stoechiométriques, ce qui n’est pas le cas ici. Il ne faut pas oublier que dans les expériences d’empreinte à la DNaseI (liaison à l’ADN en conditions stoechiométriques), le tampon de complexation comprenait toujours du K+ qui pourrait éventuellement être lié par EcNikR (Bloom & Zamble, 2004; Chivers & Sauer, 2000). Il est également possible qu’EcNikR se lie à pnikA-Fl entre 0 et 1 équivalent de Ni(II) ajouté mais que nous ne puissions pas mesurer cette liaison (bruit de fond). Les variations d’anisotropie sont très faibles. Ces conditions expérimentales ne sont pas optimales pour étudier la liaison d’EcNikR à l’ADN.