Les caractérisations biochimiques et biophysiques des domaines N-ter (résidus 1 à 47 couplés à un tag de 6His), C-ter (résidus 48 à 133) ainsi que de la protéine native ont permis de mettre en évidence qu’EcNikR est un tétramère ou plus exactement un dimère de dimère (Chivers & Sauer, 1999; Chivers & Sauer, 2002). La structuration des domaines N-ter et C-ter a lieu indépendamment. Les domaines N-ter, riches en hélice α (56%), s’homodimérisent ; la constante de dissociation du dimère en monomère est de 9,9.10-11 M (Chivers & Sauer, 1999). Les domaines C-ter, quant à eux, forment un homotétramère en présence ou en absence de métal. La liaison du nickel dans les sites métalliques modifie la structure secondaire de la protéine native ainsi que du domaine C-ter en augmentant le pourcentage d’hélice alpha comme cela a été observé en CD (Chivers & Sauer, 2002).
Ces premières caractéristiques structurales ont été confirmées lors de la résolution par diffraction des rayons X des structures tridimensionnelles de la protéine EcNikR apo (résolution : 2.3Å (Schreiter et al., 2003)) (Figure I.26) et plus récemment d’EcNikR métallée (résolution : 2.1Å (Schreiter et al., 2006)) (Figure I.27). Ces différentes structures vont être présentées.
I.3.3.1. Structure de la protéine EcNikR apo
Une sous unité monomérique de cette protéine tétramérique comprend deux domaines (Figure I.26B) :
• Le domaine N-ter impliqué dans la liaison à l’ADN. Il présente un repliement de type βαα qui forme le domaine de liaison à l’ADN par dimérisation avec le domaine N-ter d’une seconde sous unité adjacente.
• Le domaine C-ter impliqué dans la tétramérisation ainsi que dans la métallation. Il présente un repliement de type βαββαβ caractéristique des domaines ACT*. Ces
domaines sont retrouvés dans de nombreuses protéines dont certaines enzymes impliquées dans le métabolisme des acides aminés et des purines. La liaison de petites molécules (acides aminés, Ni(II)…) dans ce domaine y est permise, elle tend à réduire la flexibilité structurale et semble corrélée à des mécanismes de régulation allostérique (Grant, 2006). Ces mécanismes restent à définir.
Chaque homodimère comprend un domaine de liaison à l’ADN, ainsi qu’un cœur constitué des domaines C-ter de chaque sous unité (Figure I.26A). Le tétramère est maintenu par des interactions hydrophobes ainsi que par des liaisons hydrogènes entre les brins β3 des monomères adjacents à l’interface de tétramérisation. En absence de métal, l’hélice α3 est plus flexible et désordonnée, elle n’est d’ailleurs visualisée que sur une sous-unité monomérique. EcNikR apo fait approximativement 90 Å de long (distance entre chaque domaine de liaison à l’ADN). Dans cette conformation, EcNikR apo ne peut se lier à l’ADN.
Figure I.26 Structure tridimensionnelle de EcNikR apo de résolution 2.3Å (Schreiter et al., 2003). A) Structure
entière B) Une sous-unité monomérique. Le domaine N-ter d’une sous unité monomérique avec le repliement ruban-hélice-hélice est en bleu et le domaine C-ter équivalent, avec un repliement caractéristique d’un domaine ACT, est en jaune. L’interface de tétramérisation est marquée par la flèche.
* ACT : Aspartate kinase-Chorismate mutase-TyrA (3 premières lettres de 3 enzymes ayant un tel domaine) ; Par
touchent essentiellement l’hélice α3 ainsi que la boucle entre les brins β3 et β4. L’hélice α3 qui contient un des ligands du site de haute affinité H76, se voit ordonnée dans chaque C-ter. Les brins β3 et β4 d’une même sous-unité monomérique, quant à eux, contiennent les 3 autres ligands du site métallique adjacent. La liaison du nickel dans le site de haute affinité entraîne un mouvement au niveau de la boucle liant les deux brins afin de les rapprocher et donc rapprocher les ligands pour former les sites (Figure I.27C). La chaîne latérale de His 89 subit un déplacement de 2.6 Å.
Ces observations ont été confirmées et complétées lors de la résolution en 2006 de la structure complète d’EcNikR métallée (Figure I.27A et C) (Schreiter et al., 2006).
Figure I.27 Structures tridimensionnelles de EcNikR métallée et apo (Schreiter et al., 2003; Schreiter et al.,
2006). A) Structure d’EcNikR métallée de résolution 2.1 Å, l’interface de tétramérisation est visualisée par la flèche, les éléments de la structure secondaire ont été précisés. B) Superposition d’EcNikR apo (bleu foncé) et d’EcNikR métallée (gris clair). C) Deux domaines ACT d’EcNikR métallée et apo, visualisation du mouvement de la boucle entre les brins β3 et β4 lors de la métallation. L’hélice α3 non résolue d’EcNikR apo est représentée par la ligne.
La structure d’EcNikR métallée est comparable à celle d’EcNikR apo et du domaine de tétramérisation métallé.
Toutefois l’orientation des domaines de liaison à l’ADN par rapport au domaine de tétramérisation est différente (Figure I.27B). Ce positionnement suggère que ces deux domaines « rigides » se déplacent l’un par rapport à l’autre grâce au domaine de liaison flexible qui les lie (résidus 41-52). Cette flexibilité relative, observée en absence d’ADN, est en accord avec les structures décrites pour NikR de Pyrococcus horikoshii (PhNikR). PhNikR peut adopter plusieurs conformations : Ouverte ou Fermée avec un positionnement Trans ou Cis (modèle) des domaines de liaison à l’ADN (Figure I.28) (Chivers & Tahirov, 2005).
Figure I.28 Structures tridimensionnelles de PhNikR métallée (A : conformation ouverte, B : conformation
Trans-fermée) et modèle du complexe PhNikR-Ni-ADN (C). Trois classes de sites à Ni(II) ont été proposées, z
Ni(II) dans le site de haute affinité, { Ni(II) dans le site auxillaire et z Ni(II) dans le site dit de basse affinité. Structures tirées de (Chivers & Tahirov, 2005).
Par ailleurs, la résolution de différentes structures cristallographiques de PhNikR, qui comprend aussi un site dit de haute affinité, a permis de décrire deux autres catégories de sites potentiels à nickel (Chivers & Tahirov, 2005). Le premier site décrit a été qualifié de site auxiliaire. Il se situe à l’interface de tétramérisation et implique 3 résidus : His64, Asp65 et Asp 75’. Cependant les résidus Asp65 et Asp75’ ne sont pas conservés parmi les espèces. Ce site ne serait donc pas caractéristique des protéines NikR. Le second site décrit se situe entre le domaine N-ter et le domaine C-ter. Le nickel serait coordiné au minimum par les résidus
la structure du complexe EcNikR-Ni-ADN comme nous allons le voir. I.3.3.3. Structure du complexe EcNikR-Ni-ADN
Récemment, la résolution à 3.1 Å de la structure tridimensionnelle du complexe EcNikR-Ni- ADN (Schreiter et al., 2006) a permis de décrire un nouveau site métallique et de confirmer la conformation « cis-fermée » adoptée par EcNikR métallée pour se lier à l’ADN (Figure I.29). Un tel modèle de liaison avait été proposé auparavant pour la liaison de PhNikR-Ni à l’ADN (Figure I.28C) (Chivers & Tahirov, 2005).
Figure I.29 Structure tridimensionnelle du complexe EcNikR-Ni-ADN de résolution 3.1 Å (A) (Schreiter et al.,
2006) et agrandissement du domaine de liaison à l’ADN (B). ADN : 30pb du promoteur pnik. En bleu : Domaine de liaison à l’ADN d’un dimère, les résidus R3, T5 font des liaisons hydrogènes avec les bases du grand sillon; En jaune : Domaine de tétramérisation et liaison du Ni(II) z ; Site à K+ z : décrit entre le domaine Nter et Cter
coordiné par les ligands E30 et D34; En violet : des interactions entre les résidus K64-R65 de α3 et l’ADN Ì.
L’orientation des domaines de liaisons à l’ADN diffère significativement de celle observée pour la protéine apo ou métallée (Figure I.26A et Figure I.27A). Une rotation de ce domaine autour du domaine flexible réoriente les feuillets β antiparallèles leur permettant alors d’interagir avec le sillon principal de la séquence opératrice.
Différentes interactions entre EcNikR et la séquence opératrice ont été répertoriées :
• Interaction spécifiques : liaisons hydrogènes entre les chaînes latérales de R3 et de T5 et des bases nucléotidiques.
• Interactions qualifiées de non spécifiques entre le domaine de liaison à l’ADN et les phosphates de l’ADN ainsi qu’entre le domaine de tétramérisation et l’ADN (interactions entre K64-R65 et les phosphates de l’ADN)
En présence d’ADN, un second site métallique est observé entre le domaine Nter et le domaine Cter. Il est analogue à celui décrit chez PhNikR à la différence près qu’il contient du potassium et non pas du nickel.
Figure I.30 Alignement des séquences de EcNikR et PhNikR sur lesquelles ont été précisés les ligands des sites
de haute affinité * et de basse affinité à Ni(II) z pour PhNikR et K+ { pour EcNikR. Les ligands stabilisateurs
du site à Ni(II) et à K+ sont indiqués par } et respectivement.
Le potassium est coordiné par les résidus Glu30 et Asp34 (résidus conservés) du domaine N- ter ainsi que par l’oxygène du carbonyle de Ile116, Gln118 et Val121 du domaine de métallation (Figure I.30). Les deux résidus Glu30 et Asp34 semblent essentiels pour observer une liaison à l’ADN en gel retard (Schreiter et al., 2006). Ce site à potassium semble nécessaire pour que EcNikR se lie à l’ADN. Mais il n’explique pas pourquoi un excès de nickel augmenterait l’affinité de la protéine pour l’ADN. En effet il n’est pas prouvé que le nickel puisse être lié dans un tel site et remplacer le potassium.
En effet, après un trempage des cristaux du complexe NikR-Ni-ADN dans une solution de nickel, d’autres sites ont été observés, mais aucun ne correspond au site à K+. Ces nouveaux sites sont au nombre de six, les ligands sont répertoriés dans le tableau suivant :
Site Ligands impliqués
1 Met1 2 His125, His125' 3 His79, His92' 4 His78, His110, D114 5 His48 6 Asp104, Asp107
Tableau I-11 Les autres sites à nickel observés lors du trempage des cristaux du complexe NikR-Ni-ADN dans
spectroscopiques (XANES, EXAFS) a été menée en présence d’ADN (Leitch et al., 2007). Pour ce faire, une double métallation de la protéine a été réalisée, en considérant les affinités relatives de cette dernière pour les différents ions métalliques. La métallation du site de haute affinité d’EcNikR a dans un premier temps été faite avec du cuivre. La protéine ainsi métallée était ensuite mise à incuber avec l’ADN avant que du nickel ne lui soit ajouté en sous- stoechiométrie. Le second site dit de « basse affinité à nickel » présenterait une géométrie octaédrique et impliquerait 2 résidus imidazoles ainsi que 4 ligands N/O. Il a été proposé que ce site de basse affinité ne soit « correctement » formé qu’en présence d’ADN. La liaison de nickel dans le second site dit de basse affinité entraîne des modifications subtiles du site de haute affinité. Il existerait donc « une communication » entre les deux sites (Leitch et al., 2007).