Les visibilit´es

4.1 Seleção das Amostras de Pacientes

A seleção dos pacientes para o estudo foi efetuada durante o período de 2 anos e realizada no Laboratório de Hematologia do Hemocentro Dalton Barbosa Cunha - HEMONORTE.

Foram coletadas amostras de 151 pacientes com histórico de linfocitose persistente com a seguinte distribuição: 80 casos de LLC-B, 13 DLPC-T (4 ATLL, 3 SS, 6 PLL-T), 2 MM, 4 HCL, 48 LNH-B em fase leucêmica e 4 LPLP-B.

O diagnóstico dessas leucemias baseou-se em critérios clínicos e laboratoriais. Estes últimos incluíam o hemograma, contagem de plaquetas e imunofenotipagem celular por citometria de fluxo, cujo painel encontra-se na (Tabela 9). Destes foram selecionados para o presente estudo apenas os 80 casos de LLC-B.

Informações a respeito dos pacientes foram obtidas no momento em que as amostras deram entrada no Laboratório de Hematologia. Durante a coleta das amostras foram anotados dados demográficos, clínicos e laboratoriais dos pacientes ou por análises dos prontuários arquivados no arquivo médico do HEMONORTE. Um modelo pré-definido para a coleta de dados incluiu etnia, sexo, idade, dosagem de hemoglobina, contagem de plaquetas, leucometria global e contagem diferencial dos leucócitos.

4.2 Metodologia

4.2.1 Hemograma e Estudo Citomorfológico

Estudos citomorfológicos de distensão de SP e / ou MO dos pacientes foram realizados após coloração pelo Leishman. As lâminas depois de coradas foram examinadas no microscópio ótico, inicialmente com objetiva de 40 e, posteriormente, com objetiva de 100. Na avaliação morfológica de distensão do sangue periférico (SP), procedeu-se a contagem específica de leucócitos, além das observações de alterações morfológicas adicionais, tais como presença de células atípicas, pro-linfócitos e restos nucleares, comumente observadas em distensões sanguíneas de portadores de LLC-B.

O sangue periférico dos pacientes foi coletado em frascos à vácuo marca “vacutainer” com EDTA potássico para hemograma rotineiro. A leucometria foi realizada no analisador hematológico e a contagem diferencial em distensões de sangue periférico após coloração pelo leishmann.

4.2.2 Imunofenotipagem

A imunofenotipagem foi realizada por citometria de fluxo em um aparelho FACS- calibur da Becton Dickson, utilizando-se um painel de AcMo, diretamente conjugados com fluorocromos, como o isotiocianato de fluoresceína ou FITC do inglês fluorescein

isothiocyanate e / ou Phicoeritrina (PE) e / ou proteína do chlorophyll de Peridinin (PerCP). Dessa forma, com fluorescências verde, laranja e vermelha, respectivamente, possibilitando a dupla ou tripla marcação em uma única etapa (imunofluorescência direta), possibilitando a identificação de antígenos relacionados a células T e precursores (CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7 e CD8), linfócitos B e precursores (CD10, CD19, CD22, CD23, CD20, anti-IgM, IgH, IgD e cadeia leves das imunoglobulinas, kappa e lambda), além de antígenos de linhagem não específica (CD45, HLADR, CD25, CD38, FMC-7, ZAP-70, CD103, CD138) (Tabela 9).

4.2.3 Marcação de Antígenos de Superfície

A reação de imunofluorescência direta foi realizada em 50 microlitros ( L) de suspensão de células totais (MO e/ ou SP) previamente homogeinizados, as quais foram incubadas com 20 L de AcMo específico por 30 minutos no escuro, à temperatura ambiente. Após esta etapa, a suspensão foi novamente homogeneizada e acrescentada à mesma cerca de 2 mililitros (mL) de solução de lise, havendo nova incubação por mais 10 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após este período, a suspensão celular foi centrifugada por 5 minutos a 1500 g, o sobrenadante desprezado e o sedimento resuspenso em PBS e novamente centrifugado a 1.500 g em centrifuga EXELSA BABY II 206- BL marca FANEM por 5 minutos, sendo esta última etapa realizada mais 2 vezes consecutivas. Ao final desta etapa, o sedimento foi então ressuspendido em 1 mL de solução de PBS/ formaldeído a 1% e estocado ao abrigo da luz, sob refrigeração, até o momento da leitura e análise.

celular em soro humano do grupo sanguíneo AB previamente inativado e diluído na concentração de 2% em PBS, por 20 minutos a 37ºC. Após este procedimento, foi realizada uma lavagem da suspensão celular com PBS, procedendo-se em seguida a incubação com os anticorpos anti e anti .

Em todos os casos analisados, foram utilizados um controle de auto-fluorescência inespecífica com um conjugado IgG marcado com fluorocromos (Gama 1FICT / gama 2PE -

Becton Dickinson). A leitura e as análises foram realizadas em um citômetro de fluxo

(Fluorescence Activated Cell Analyser - Facs-can da Becton Dickinson, San-Jose, Ca, USA), utilizando-se o software cell quest, com aquisição de 20.000 eventos, tendo como parâmetros

Forward Scatter (FSC) em escala linear que avalia o tamanho celular, Side Scatter (SSC)

também em escala linear, que determina a complexidade e granulosidade celular, além de FL1, FL2 e FL3 em escala logarítmica que detectam as fluorescências: verde, laranja e vermelha, ou seja, a reação antígeno anticorpo conjugado ao FICT, PE e PerCP, respectivamente.

4.2.4 Marcação de Antígenos Intracitoplasmáticos

Por se tratar de antígenos cujos epítopos se encontram localizados no citoplasma, foi necessária a prévia permeabilização celular, possibilitando dessa forma o direcionamento e reatividade do AcMo para o antígeno ZAP-70PE, o qual foi conjugado juntamente com o antígeno CD22FITC (Becton Dickinson´s FACS lysing ) para a permeabilização celular.

Cerca de 50 L de amostra de suspensão celular de SP por tubo foi incubada com solução de lise previamente diluída a 10% em água destilada por 10 minutos à temperatura ambiente, seguido de uma centrifugação a 1.500 g por 7 minutos, descarte do sobrenadante e homogeneização do sedimento. Após ressuspender o sedimento em 2 mL de solução de Tween-20 diluído a 0,5% em PBS (Tween-20 / BHD, England), esta mistura foi centrifugada 2 vezes a 1.500g.

Após o descarte do sobrenadante, o sedimento foi homogeneizado e adicionado sobre o mesmo 10 L do AcMo ZAP-70 e anti CD22, seguida de uma incubação por 30 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após esta etapa, o sedimento foi homogeneizado em 2 mL de solução de PBS/Tween-20, seguida de centrifugação a 1.500 g por 5 minutos, desprezado o sobrenadante e o sedimento ressuspendido e submetido a mais uma lavagem com solução de PBS/Tween-20. Após o descarte do sobrenadante, ao sedimento final foi

adicionado 1 mL de solução de formaldeído diluído a 1% em PBS (Formaldeído PA / Vetec, Brasil) e estocado na geladeira ao abrigo da luz até o momento da leitura e análise no CF.

Para cada amostra foi utilizado um tubo controle de marcação inespecífica, empregando-se para tal, imunoglobulina inespecífica conjugada ao FITC diluída conforme as especificações do fabricante.

4.2.5 Leitura e Análises

A leitura e as análises foram realizadas em um citometro de fluxo (FACScalibur da

Becton e Dickinson), utilizando-se o programa Cell Quest, com aquisição de 10.000 eventos, levando-se em conta os parâmetros Forward Scatter (FSC) em escala linear que avalia o tamanho celular, Side Scatter (SSC) também em escala linear, o qual avalia a complexidade e granulosidade celular, FL1, FL2 e FL3 em escala logarítmica que detectam a fluorescência verde e laranja, ou seja, a reação antígeno anticorpo conjugado ao FICT, PE e PerCP respectivamente.

Os Resultados foram fornecidos na forma de histogramas em percentagem da população celular com reação positiva ou negativa e intensidade de fluorescência (Figura 3).

As imunofenotipagens foram consideradas positivas quando mais que 25% de células leucêmicas reagiram contra os antígenos B relacionados CD45 e HLADR. No caso dos antígenos CD38, CD25 e ZAP-70, Linfócitos T e células NK, além das cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas os resultados foram levados em consideração independente nos níveis de expressão. Os resultados foram fornecidos na forma de histogramas em percentagens da população celular com reação positiva ou negativa. Avaliação de intensidade de expressão também foram devidamente observadas nos histogramas emitido pelo citometro para posterior auxílio na interpretação dos resultados.

Tabela 9: Anticorpos monoclonais empregados neste estudo

ANTÍGENOS RELACIONADOS A LINFÓCITOS T e B

ANTICORPOS ESPECIFICIDADE MARCA

COMERCIAL

CD3/CD19/CD45 Linfócitos T e B Becton-

Dikinson CD4/CD8/CD3 Linfócitos T e subpopulações Becton-

Dikinson CD103/CD22/CD20 Antígeno relacionado a Hairy Cell /

Linfócitos B

Becton- Dikinson CD3/CD16-

56/CD45

Linfócitos T / Células Natural Killer / Leucócitos

Becton- Dikinson

CD22 Linfócitos B e precursores Becton-

Dikinson

CD23 Linfócitos B Becton-

Dikinson

CD79a Linfócitos B e precursores Becton-

Dikinson CD10 Antígeno Comum da Leucemia

Linfóide Aguda

Becton- Dikinson

CD20 Linfócitos B e precursores Becton-

Dikinson

CD2 Linfócitos T e precursores Becton-

Dikinson

CD7 Linfócitos T e precursores Becton-

Dikinson

CD5 Linfócitos T e precursores Becton-

Dikinson

CD1a Timócitos Corticais Pharmigen