Les types simples

4.4.1. Parasitológico

Os insetos coletados foram submetidos à técnica de compressão abdominal para obtenção de fezes e realização de diagnóstico parasitológico direto de Tripanosomatídeos. Foram utilizadas duas técnicas para o diagnóstico parasitológico: 1)

exame a fresco (2 ou 3 lâminas por inseto), onde as fezes eram diluídas em solução

salina (NaCl 0,9%), sobre lâmina e coberta com lamínula, com leitura de no mínimo 100 campos a um aumento de 400x em microscopia óptica; 2) lâminas coradas por Giemsa, dez porcento das lâminas negativas, as duvidosas e as positivas para tripanosomatídeos foram pré-coradas com azul de metileno e coradas com Giemsa (técnica de Walker) para uma nova leitura, também de no mínimo de 100 campos para cada lâmina, com aumento de 1.000x em microscopia óptica (FIOCRUZ, 2008).

O diagnóstico parasitológico do T. cruzi foi realizado em parceria dos Laboratórios de Entomologia do Núcleo de Controle de Vetores da Coordenadoria de

Vigilância em Saúde da Secretaria Estadual da Saúde em Fortaleza (NUVET / COVIG / SES-Ce) e do LATEC do IRR/FIOCRUZ-MG.

4.4.2. Caracterização do Trypanosoma cruzi segundo DTUs

Na rotina de trabalho, o grupo do LATEC optou pela metodologia proposta por (D'avila et al., 2009), que descreveram um ensaio tríplice que mostrou ser eficiente, rápido e de baixo custo. Este esquema propõe a classificação considerando o polimorfismo do gene mitocondrial Citocromo Oxidase II (De Freitas et al., 2006); da amplificação do espaçador intergênico SL-IL do mini-exon do T. cruzi (Burgos et al., 2007) e do domínio divergente D7 do gene 24αrDNA - LSU rDNA (Souto et al., 1996) (Figura 16), tais marcadores são considerados de evolução lenta. Essas metodologias de genotipagem estão descritas abaixo. Todas as reações foram realizadas empregando controles positivos e negativos em todas as etapas.

4.4.2.1. Amostras

Após confirmação do diagnóstico parasitológico, os parasitos foram mantidos em cultura líquida (LIT-Liver Infusion Tryptose). As amostras que apresentaram contaminação por fungos foram descartadas. As demais foram mantidas em crescimento exponencial para obtenção de aproximadamente 105 parasitos/mL de cultura. Após centrifugação (2.500 rpm, 4°C, por 10 minutos), o sobrenadante foi desprezado cuidadosamente por inversão e, ao sedimento foi adicionado 10 mL de solução salina tamponada estéril (PBS). A mistura foi submetida a nova centrifugação, nas mesmas condições descritas anteriormente. Após duas repetições desse procedimento, o sedimento foi transferido para um tubo de microcentrifugação de 1,5 mL. Uma última lavagem deste sedimento com PBS estéril foi realizada sob as mesmas condições de centrifugação, o sobrenadante foi cuidadosamente eliminado e a massa úmida armazenada a -70°C para posteriores análises moleculares. O DNA foi extraído pelo método fenol-clorofórmio conforme descrito por Vallejo et al. (1999).

Para obtenção do DNA das amostras, a partir do sedimento obtido como no item anterior, foram necessárias três etapas:

a) lise e digestão celular: o sedimento foi diluído em 350 µL de tampão de lise TE

(pH 8,0 Tris-HCl 10mM, EDTA 10mM, SDS 10%) e 20 µL de Proteinase K (20mg/mL), e incubado por 12 horas, a 56°C, em banho-maria;

b) desproteinização: foram realizadas duas extrações fenólicas. O fenol foi adicionado

(v/v) e homogeneizado por 5 minutos, sendo em seguida centrifugado a 13.000 rpm, por 10 minutos, a 4ºC, com recuperação da fase aquosa. A seguir, no sedimento da primeira extração, foram realizadas duas extrações com clorofórmio e álcool isoamílico. O sedimento foi homogeneizado por 10 minutos e centrifugado a 13.000 rpm, por 10 minutos, a 4ºC, sendo a fase aquosa recuperada;

c) para a precipitação do DNA, foi adicionada à fase aquosa, uma solução de acetato

de sódio 3M, na proporção 1/10, e 2,5X de etanol absoluto gelado. A seguir, os tubos foram mantidos por uma hora a −70ºC, centrifugados a 13.000 rpm, por 10 minutos, a 4°C. O DNA extraído foi lavado duas vezes com 850 µl de etanol 70 gelado e centrifugado a 13.000 rpm por 10 minutos a 4°C. Posteriormente, o DNA foi resuspendido em 100µl de água destilada ultrapura e estocado a −20°C. A concentração de DNA nas amostras foi quantificada em espectrofotômetro a 260nm e o grau de pureza das amostras determinado pela relação das absorbâncias a 260/280nm.

4.4.2.3. Caracterização pela PCR do gene Mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade II (CO II)

Primeiramente o DNA das amostras foi submetido a uma PCR composta de 10mM Tris-HCl pH 8,4, 50mM KCl, 0,1% Triton X-100, 1,5mM MgCl2, 1U Taq DNA Polimerase (Platinum, Invitrogen), 250µM de cada dNTP, 0,3µM dos iniciadores Tcmit- 10 (5‟- CCATATATTGTTGCATTATT-3‟) e Tcmit-21 (5‟-TTGTAATAGGA GTCATGTTT- 3‟ ), 1 µL de DNA e quantidade de H2O estéril suficiente para completar 10µL.

Para amplificação do fragmento de 375pb do maxiciclo de DNA do T.cruzi foi utilizado a seguinte termocicliagem: desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguido de 40 ciclos contendo um passo de desnaturação a 94°C por 45 segundos, um anelamento a 48°C por 45 segundos e uma extensão final a 72°C por 1 minuto.

Posteriormente, os produtos das amostras foram submetidos à digestão empregando-se a enzima de restrição AluI por 16h, conforme instruções do fabricante (Promega). Os fragmentos gerados foram visualizados em gel de poliacrilamida a 6%, corado pela prata.

A digestão de DNA usando a enzima de restrição AluI gera três padrões de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorphism) do gene mitocondrial da coenzima II para cepas de T. cruzi. O padrão com três fragmentos de tamanhos 30, 81 e 264 pares de bases (pb) são classificados como TcI (haplótipo mitocondrial A), com 81, 82 e 212 pb são classificados como TcII (haplótipo mitocondrial C) e com 81 e 294 pb são classificados TcIII, TcIV, TcV ou TcVI (haplótipo mitocondrial B) (D'avila et al., 2009) (Figura 16).

4.4.2.4. Caracterização pela região do espaçador intergênico do gene mini-exon (SL- IR)

As amostras que apresentaram perfil de banda correspondentes a 81+ 294 pb na caracterização do gene Mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade II foram submetidas a amplificação do espaçador intergênico do gene mini-exon (SL-IR).

A amplificação do gene SL-IR forma dois clusters: TcIII e TcIV (200 pb); TcV e TcVI (~150 pb) (Figura 16) (Burgos et al., 2007).

Para amplificar esta região do T. cruzi, o DNA das amostras foi submetido a uma PCR contendo 20 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl, (Tampão PCR, 10x, Invitrogem); 3 mM MgCl2; 250 μM de cada dNTP; 3μM de cada iniciador TcIII (5‟- CTCCCCAGTGTGGCCTGGG-3‟) e UTCC (5‟-CGTACCAATATAGTACAGAAA CTG-3‟); 1U Taq DNA polimerase Platinum (Invitrogen, USA); 3ng de DNA total e quantidade de H2O suficiente para completar 10μL.

Os ciclos de amplificação da PCR consistiram de uma etapa inicial de desnaturação a 94°C por 3min, anelamento a 68°C por 1 min e extensão a 72°C por 1 min. Nos ciclos subsequentes o tempo de desnaturação foi reduzido a 1 min e a cada três ciclos, a temperatura de anelamento foi diminuída para 66, 64, 62 e 60°C sequencialmente. Na última temperatura, o número de ciclos foi aumentado para 35, seguido de uma extensão final a 72°C por 10 min.

A análise dos produtos amplificados foi realizada em gel de agarose 2% marcados com Gel Red Nucleic Acid Stain da Biotium 1:300. Os géis foram analisados no transiluminador L.PIX, Loccus biotecnologia – Molecular imaging (Figura 16).

4.4.2.5. Caracterização pela amplificação da região 3’ do gene 24sα rDNA - LSU rDNA

Como terceira etapa da caracterização dos isolados de T. cruzi, as amostras que apresentaram 81+ 294 pb através do gene COII foram submetidas a amplificação do domínio divergente do gene D7 da subunidade 24Sα do rDNA (LSU rDNA), empregando a metodologia descrita por (Souto et al., 1996). Cujo resultado permite a subdivisão dos

clusters anteriormente citadas nas quatro DTUs: (TcIII-110pb; TcIV- ~ 119pb; TcV-110 +

125pb e TcVI-125pb) (Figura 16).

A reação foi processada em um volume final de 10μL contendo: 10mM Tris- HCl (pH 9,0); 50mM KCl; 0,1 % Triton X-100; 3,5mM MgCl2 0,625U Taq DNA Polimerase (Platinum, Invitrogen); 200µM de cada dNTP; 0,25μM dos iniciadores D71 (3'-AAGGTGCGTCGACAGTGTGG-5‟) e D72 (5‟-TTTTCAGAATGGCCGAA CAGT- 3‟), 1µL de DNA (3ng) de cada amostra e H2O. A PCR foi realizada utilizando o seguinte ciclo de amplificação: desnaturação inicial a 94°C por 4 min, seguido de 30 ciclos para três temperaturas: 94°C, 60°C e 72°C por 1 minuto cada. Todas as amplificações foram realizadas no termociclador Verit® 96-Well Thermal Cycler (The Applied Biosystem®). Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida a 8%, corado pela prata.

A caracterização molecular dos T. cruzi foi realizada com a colaboração do Instituto René Rachou, da Fundação Oswaldo Cruz, em Belo Horizonte (IRR/FIOCRUZ MINAS-MS).