Les techniques de clonage

a) SLIC

La méthode SLIC permet comme son nom l’indique de s’affranchir de l’étape de ligation et ne nécessite pas l’intervention d’enzymes de restrictions. Elle est basée sur le principe de la recombinaison homologue entre l’insert et le vecteur de destination et se déroule en plusieurs étapes :

Etape 1 : Linéarisation du vecteur par PCR en utilisant une polymérase Phusion. Les primers utilisé présentent une partie de la séquence du gène à intégrer de manière à permettre la reconnaissance homologue. Une fois le vecteur linéarisé amplifié, un traitement à DpnI permet de dégrader le vecteur circulaire initial, méthylé, et de conserver le vecteur néo synthétisé, linéaire et non-méthylé. De plus le vecteur est également traité avec la CIP, une phosphatase alcaline permettant la déphosphorylation en 5’ et 3’ de l’ADN. Parallèlement l’insert est également traité par PCR, pour l’insertion de bornes complémentaires à celles du vecteur.

Etape 2 : Le vecteur et l’insert sont traités ensemble par la T4 DNA polymérase. En absence de dNTP, la polymérase présente une activité 3’-5’ exonucléase qui permet la digestion un à un des nucléotides, formant ainsi des extrémités cohésives. Cette étape est rapide est ne nécessite qu’une incubation d’environ 3 minutes à température ambiante.

Etape 3 : Le produit est alors transformé dans des bactéries E. coli DH5α. La ligation du vecteur et de l’insert s’effectue naturellement dans la bactérie au cours du processus de réplication. Les bactéries sont finalement étalées sur une boîte de pétri de LB agar additionné d’antibiotique, et laissé à 37°C sur la nuit.

b) RF-free

Cette méthode de clonage, permet l’insertion de séquence à n’importe quelle position dans le plasmide vecteur sans l’intervention d’enzymes de restrictions. Pour cela une paire d’amorces est conçue contenant une séquence complémentaire à la fois de l’insert désiré et du plasmide cible. Ces deux amorces sont par la suite utilisées pour amplifier le gène d’intérêt par PCR. Le produit résultat est purifié et utilisé comme méga-amorce pour une seconde PCR utilisant le

146 plasmide vecteur comme matrice. Le plasmide est dès lors amplifié dans les deux directions. Par la suite l’ajout de DpnI permet la dégradation des plasmides parentaux n’ayant pas incorporé le gène, dû à leur méthylation. Le produit final est utilisé pour transformer des souches bactériennes compétentes.

Cette méthode de clonage a été utilisée pour cloner les différents gènes ci-dessous en vue de leur co-expression:

MBD3 2-260 : Cette construction se caractérise par la présence du domaine de fixation MBD et également du domaine de super-hélice responsable de l’interaction avec GATAD2A. De façon plus précise cette construction comme la suivante présentent une délétion de la queue poly-E, à l’origine des difficultés rencontrées pour la purification de la protéine en entière dans le l’équipe précédemment.

MBD3 2-267

GATAD2A : Cette construction est caractéristique de la protéine GATAD2A entière. GATAD2A domaine CC : cette construction est caractéristique du domaine super- hélice interagissant avec MBD3.

B. Expression

Les protéines étudiées sont toutes exprimées chez Escherichia coli. Pour tous les plasmides synthétisés, l’expression du gène d’intérêt est sous le contrôle du promoteur T7. Pour contrôler l’expression de la protéine par la bactérie, le plasmide recombinant est introduit dans des souches dite DE3 possédant dans leur génome un gène codant pour l’ARN polymérase T7 (provenant d’une infection par le bactériophage lambda DE3) dépendant du promoteur lac UV5 inductible par l’IPTG. Ainsi la présence d’IPTG va permettre par un mécanisme de dé-répression la transcription et l’expression de l’ARN polymérase T7 qui va initier la transcription du gène d’intérêt.

Différentes souches bactérienne d’expression sont disponibles à l’institut et ont pu être testée pour la surexpression des différentes protéines : BL21(DE3), BL21(DE3) pLysS, BL21(DE3) pLysSpRARE, BL21(DE3) pRARE.

Le protocole de transformation est le même pour les différentes souches bactériennes. 100 µl de cellules compétentes sont mises à décongelés sur glace puis 2 µl de plasmide recombinant

147 (ng/µl) sont ajoutés. Le tout est laissé sur glace pendant 15 minutes. La transformation est réalisée par un choc thermique à 42 °C pendant 45 secondes à l’aide d’un bain sec. Les échantillons sont placés par la suite sur la glace pendant 3 minutes puis suspendus dans 200 µl de milieu LB2x et incubés 1 heure à 37 °C. Pour finir les suspensions bactériennes sont étalées sur des boîtes de pétri de géloses de LB supplémentées des antibiotiques adéquats. Cette méthode va permettre de sélectionner les clones recombinants. Pour les bactéries transformées avec le vecteur pET28b la kanamycine (50 µg/ml) est utilisée. Pour celles transformée avec les vecteurs pnEAVG et pMMS il s’agira de l’ampicilline (50 µg/ml) pour BL21(DE3) et supplémenté de pour les autres souches. Les boîtes sont par la suite laissées sur la nuit à 37 degrés Celsius.

Les conditions optimales d’expression pour chacune des protéines recombinante sont identifiées par variation de nombreux paramètres tels que la souche bactérienne mais aussi la concentration en IPTG, les températures et les temps d’induction ou encore le type de milieu utilisé. Ces optimisations se font sur de petits volumes.

Le protocole d ‘expression à grande échelle reste similaire, une colonie est sélectionnées et inoculées dans 5 mL de milieu liquide dans une fiole contenant le ou les antibiotiques appropriés. La fiole est placée à 37°C toute la nuit sous agitation horizontal à 180 rpm. Ces mini-cultures vont servir à ensemencer des précultures de 100 mL de milieu supplémenté d’antibiotiques. Après quelques heures d’incubation à 37°C sous agitation, les bactéries se trouvent en phase exponentielle de croissance et sont utilisées pour ensemencer les 6L de culture de LB2x contenant les antibiotiques appropriés. Les cultures sont incubées à 37°C sous agitation (180 rpm) jusqu’à une DO600nm comprise entre 0,3 et 0,4. Puis la température

est progressivement diminuer jusqu’à 15°C, permettant d’atteindre de façon simultanée une DO600nm comprise entre 0,6 et 0.8. L’expression de la protéine est alors induite par l’ajout de

0.4 mM d’IPTG sur la nuit à 15°C sous agitation.

Le lendemain, les bactéries sont sédimentées par centrifugation (4200 rpm pendant 20 minutes) et conservées à -20°C.

C. Etudes biochimiques de MBD3 2-72 et 2-133

1. Lyse cellulaire

Les bactéries sédimentées sont pesées, le rendement obtenu pour l’expression en cellules BL21(DE3) pRARE2 est d’environ 6 grammes par litre de culture. Les cellules sont

148 resuspendues dans un tampon de lyse (200 mL pour 6 L de culture) composé de 50 mM Tris- HCl pH7.5, 200 mM NaCl, 4 mM CHAPS, 1 mM PMSF, 15 mg de lysozyme, 2 mM BME. On ajoute également des inhibiteurs de protéase (cOmplete EDTA-free, Roche), une pastille par 25 mL. Suite à la resuspension, l’échantillon est soniqué pendant deux fois 5 minutes avec une pause de 1 minute à une amplitude de 60% et des cycles de 0,6. Toutes ces étapes sont réalisées en chambre froide ou sur glace. C’est conditions sont celles optimisées pour la purification du domaine MBD de MBD3.

L’extrait total est par la suite ultracentrifugé pendant 1 heure à 35000 g de manière à séparer l’extrait soluble composé des protéines solubles, des acides nucléiques de l’extrait insoluble composé des protéines insolubles, des débris cellulaires.

Différentes étapes de purification sont nécessaires pour isoler la protéine d’intérêt à un haut niveau de pureté.

2. Chromatographie

a) Affinité

 Nickel-NTA

La première étape de purification utilisée est une chromatographie d’affinité utilisant un métal (Ni2+) immobilisé sur une résine d’agarose. Elle repose sur la capacité des noyaux imidazoles des histidines à chélater des ions divalents comme le nickel ou le cobalt. Cette technique est possible du fait de l’ajout d’une étiquette à l’extrémité N-terminale de la protéine caractérisée par six résidus histidines. La méthode choisi ici était réalisé en « batch » et ne requiert pas l’utilisation de colonne ou d’un système de type Akta. Cette méthode requiert l’incubation de l’échantillon sur la résine sous agitation. Lors de cette première étape, l’extrait soluble était directement utilisé, il est composé de résidus de membranes et de nombreux contaminant qui peuvent détériorer les systèmes Akta. De plus cette méthode permet également de pouvoir couper l’étiquette histidine lorsque la protéine est fixée à la résine et limiter la quantité de contaminant libérer par une élution.

Pour cette méthode la résine est équilibrée avec cinq volumes de tampon À (20 mM Tris-HCl pH7,5, 200 mM NaCl, 10 mM d’imidazole, 4 mM de CHAPS et 2 mM de BME). L’extrait soluble est incubé sur la résine pendant environ 1 heure en chambre froide à 4 degrés sous rotation constante. La résine est par la suite lavée avec le même tampon jusqu’à ce que

149 l’absorbance à 280 nm soit proche de 0. Le dernier lavage est réalisé avec une solution similaire au tampon A avec 20 à 40 mM d’imidazole, ce qui va permettre d’éliminer les protéines fixées de façon non spécifiques.

Pour récupérer la protéine, deux méthodes sont utilisées :

La première est réalisée pour conserver l’étiquette 6xHis. Pour cela la protéine est éluée en plusieurs étapes avec un tampon B (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 200 mM NaCl, 250- 300 mM d’imidazole, 4 mM de CHAPS et 2 mM de BME). L’élution est fractionnée manuellement soit par centrifugation successives soit par l’utilisation de colonne dans laquelle la résine est coulée est l’élution se fait par gravité.

La seconde technique est utilisée pour éliminer la queue histidine. Pour cela suite au lavage de la résine environ 15 mL de tampon A est utilisé pour resuspendre la résine implémenté par la protéase P3C (1/100 de la concentration en protéine). L’incubation avec la protéase se fait sur la nuit en chambre froide sous rotation continue. Le lendemain le surnageant est récupéré par centrifugation (700 g pendant 2 minutes). La résine est lavée pour récupérer la protéine clivée. Pour cette méthode une étape supplémentaire dite de Nickel inverse est nécessaire à l’élimination de la protéase HRV 3C présentant une étiquette 6xHis.

 Héparine

Cette étape de purification est réalisée à la suite de la purification sur résine Nickel. L’héparine est un glycosaminoglycane, qui, dû à sa structure et ses charges négatives est capable de mimer la structure de l’ADN. Cette méthode est donc idéale à la purification de protéines liant l’ADN.

Pour cela, une colonne HiTrap Héparine 5 mL (GE Healthcare) a été utilisée. La résine de cette colonne correspond à des billes de Sepharose-6B modifiée par la présence d’héparine. L’échantillon est appliqué sur la colonne et la colonne est nettoyée avec un tampon héparine A à 70% (20 mM Tris-HCl pH7,5, 5 mM EDTA, 2 mM CHAPS, 3 mM DTT) et 30% d’un tampon B (20 mM Tris-HCl pH7,5, 1 M NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM CHAPS, 2 mM DTT). La protéine est éluée par un gradient croissant en tampon héparine B qui va augmenter la force ionique et ainsi déstabiliser l’interaction protéine-héparine.

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b) Echangeuse d’ions

De façon à éliminer l’ADN contaminant qui serait fixé au domaine MBD de MBD3 un autre type de chromatographie fut testé. Il s’agit d’une échangeuse d’ions et plus précisément ici, d’une échangeuse d’anions. Cette technique se base sur la charge des protéines. En effet, la charge nette des protéines varie en fonction du pH de la solution tampon. A un pH supérieur au pI la protéine est chargée négativement et lorsque le pH est inférieur au pI la charge nette sera positive. Les colonnes échangeuses d’anions de type mono Q-sepharose, les protéines possédant une charge nette négative vont se fixer aux groupements triméthyl ammonium chargés positivement de la résine. Le point isoélectrique du domaine MBD est d’environ 9.1, à pH7,5, la charge nette de la protéine est donc positive et ne va pas permettre l’interaction avec la résine. A l’inverse de l’ADN chargé négativement qui lui sera retenu. L’ADN sera élué en appliquant un gradient de NaCl de 300 mM à 1 M.

Une colonne de gel monoQ-sepharose de 5 mL (GE Healthcare) est équilibrée avec cinq volumes de tampon MonoQ-A (20 mM Tris-HCl pH7,5, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM CHAPS, 3 mM DTT). L’échantillon est appliqué sur la colonne à un débit de 2 mL/min. L’échantillon non fixé à la résine est récupéré il s’agit de l’échantillon contenant MBD3 nettoyé de l’ADN. Une fois cette fraction récoltée, la colonne est lavée avec le tampon MonoQ-A et les contaminants sont élués en appliquant un gradient de 300 mM à 1 M de NaCl. La fraction non retenue et les fractions éluées sont caractérisées sur gel d’électrophorèse SDS-PAGE. La présence d’ADN dans les différentes fractions est contrôlée en mesurant le ratio A260/A280 avec le nanodrop.

c) Chromatographie d’exclusion stérique

La méthode de chromatographie d’exclusion stérique ou gel filtration permet de séparer les molécules en fonction de leur rayon hydrodynamique. Ces colonnes sont composées d’une résine de granules poreuses dont la taille des pores est choisie en fonction du diamètre des protéines à séparer. A la différence des méthodes de chromatographies précédente, cette méthode ne repose donc sur aucun type d’interaction, la solution tampon n’affectera donc pas la résolution de cette technique. Cette méthode se base sur un mécanisme d’exclusion, en effet, les molécules dont le diamètre est supérieur à celui des pores, sont exclues des billes de gel et seront éluées en premières. A l’inverse, les petites protéines vont diffuser dans le gel et seront donc éluées plus tardivement. L’élution des protéines est donc inversement

151 proportionnelle à leur rayon hydrodynamique. Cette méthode permet de mettre en évidence les différentes formes moléculaires d’une protéine comme une possible dimérisation ou agrégation mais également c’est une étape supplémentaire pour séparer la protéine d’intérêt d’autres contaminants. Elle est classiquement utilisée à la fin des étapes de purification pour les changements de tampons.

Pour MBD3 deux colonnes Superdex S200 10/300 branchées en série sur le système akta, sont équilibrées avec 1 volume de tampon GF (20 mM HEPES pH7,5, 150 mM NaCl, 0.5 mM TCEP et 2 mM MgCl2). Environ 1mL d’échantillon était injecté et élué sur un volume de tampon. Des fractions de 200uL étaient collectées et analysées sur gel SDS-PAGE.