Lors des expériences de GraFix réalisées la concentration en DDM était d’environ dix fois la CMC. Communément, les détergents aident à la solubilisation des protéines et notamment par la formation de patches hydrophobes réduisant ainsi l’agrégation. La famille des détergents non-ioniques sont des détergents plus doux, moins susceptibles de dénaturer les protéines. La présence de détergents est donc fondamentale lors de la purification spécialement pour les complexes macromoléculaires ou les protéines interagissant avec l’ADN. Elle l’est beaucoup moins en cryo-EM, ou la concentration nécessite d’être réduite au minimum et à une concentration bien inférieure à la CMC. Du fait de la difficulté d’éliminer le détergent par les méthodes dites classiques, j’ai décidé de m’inspirer de la technique de GraDeR initialement développée pour les protéines membranaires. L’intérêt de cette technique est la formation d’un gradient inverse de détergent. Ainsi la concentration de détergent est réduite le long du gradient et l’élimination se fait progressivement sans être trop violent pour le complexe. De manière à stabiliser le complexe au cours de cette élimination un gradient de L-glutaraldéhyde a été ajouté. L’élimination de détergent et donc normalement compensée par la réaction de fixation qui stabilise le complexe. La purification suit le même protocole que précédemment à la différence des solutions pour le gradient. 0.01% de DDM est ajouté au tampon à 15% de saccharose et 0.1% de L-glutaraldéhyde est ajouté à celui à 35% de saccharose. En se basant sur les fractions ou se stabilise le complexe, on devrait avoir dans notre milieu environ 0.005- 0.006% de DDM et 0.05% de L-glutaraldéhyde. Lors de la réalisation des grilles, on a pu observer une glace plus épaisse empêchant toute analyse. La modification de concentration en DDM a eu un impact sur l’absorption de l’échantillon par le vitrobot. Les paramètres du vitrobot ont dû être modifiés et la force de pression a été augmentée à 7.
Les échantillons ont d’abord été vérifiés par coloration négative selon la méthode 2 présentée en figure 35 B. En parallèle du gradient de typer GraDeR-GraFix, j’ai réalisé un gradient avec peu de matériel pour sélectionner les fractions d’intérêt. Bien que communément le complexe soit stabilisé aux environ de 25% de sucrose, le gradient supplémentaire me permet de sélectionner de façon plus précise les fractions (Figure 47).
121 Figure 47 SDS gel des fractions du gradient. Le gradient s’étend de la fraction 1 correspondant à 35% de saccharose à 28 à 15% de saccharose. Les fractions encerclées de rouge sont les fractions étudiées. 1 2 4 5 7 9 10 11 12 14 15 17 18 20 21 25 26 28
122 Figure 48 Image en coloration négative. A) Coloration négative de la fraction 9 (33% de saccharose). B) Coloration négative de la fraction 14 (27% de saccharose). C) Coloration négative de la fraction 16 (25% de saccharose). En rouge sont encadrées les particules pour lesquels un agrandissement est présenté dans les figures suivantes.
A) B) C) 30 nm 30 nm 30 nm 30 nm 1 2 3 4 5 6 7 8
123 Lors de l’étude par coloration négative, la fraction 9 est également étudiée. En effet, la mesure de l’absorbance des différents échantillons à mise en évidence la présence d’une importante absorbance à 280 nm en absence de bande de migration sur le gel pour la fraction.
Les images réalisées sur le Tecnai TF20 sont présentées figure 48. On observe la présence pour la fraction 9 de particules allongées et d’autres de faibles tailles (Figure 49). De façon surprenante aucune information sur gel SDS ne corrobore la présence de protéines. L’hypothèse la plus probable serait qu’il s’agisse soit de contaminants soit du complexe NuRD ayant subi une réticulation trop importante. Les composés de cette fraction sont stabilisés à 33% de saccharose et donc doivent posséder une densité importante.
Figure 49 Grandissement de particule pour ENI-09. Particule de petite taille d’environ 12 nm. On peut discerner une organisation en domaines. Détail de la figure 48-A.
Les fractions 14 et 16, correspondent sur le gel SDS-PAGE aux fractions enrichies en complexe NuRD à une densité de saccharose de 25%. La fraction 14 semble se caractériser par des particules allongées d’environ 17-25 nm (Figure 50). Ce n’est pas la fraction la plus enrichie et elle présente peut-être un complexe NuRD de stœchiométrie différente du pic de la fraction 17. En effet lors de l’analyse de la fraction 17, on observe clairement la présence de complexes d’environ 20 nm (Figure 51). Cette observation de complexe nous permet de visualiser une organisation en domaines bien visible ici également dans différentes orientations. Néanmoins, on note une certaine hétérogénéité de forme (Figure 48 C). L’instabilité du complexe est la cause également de conformations différentes dans notre échantillon. Enfin, la dernière observation concerne la dissociation du complexe, on peut observer des complexes qui semblent se dissocier même en présence d’agents de réticulation. Ces observations peuvent être dû à l’instabilité du complexe mais également être des artéfacts de la coloration négative.
~ 12 nm A)
124 Figure 50 Grandissement de particule pour ENI-14. (A) et (B) particules allongées d’environ 24 nm identifiées sur la grille.
Figure 51 Grandissement de particule pour ENI-16. On observe une variété de forme pour ces particules. Les particules 2, 3, 4 et 5 semblent similaires mais dans des orientations différentes. Les particules 6 et 7 sont identiques. Les tailles des différentes particules varient entre 15 et 20 nm.
L’échantillon lors de cette analyse ne fut que peu dilué, la concentration observée est donc caractéristique de la fraction post-gradient. Pour la préparation des grilles de cryo-EM, la concentration devrait être de 5 fois au moins celle observée en coloration négative. Pour remédier à ce problème, après élimination du saccharose par dialyse ou dessalement,
~ 24 nm ~ 24 nm 7 8 20 nm 6 16 nm 16 nm 2 17 nm 1 20 nm 3 17 nm 4 17 nm 5 20 nm
125 l’échantillon a été appliqué deux fois sur les grilles afin de le reconcentrer sur grille. Pour cela 3 µL de la fraction 16 ont été déposés sur la grille dans le vitrobot, et l’excès de liquide est absorbé latéralement et manuellement à l’aide d’un papier filtre ou re-pipeté directement sur la grille. Suite à cela, 3 µL sont ajoutés rapidement et la grille est préparée normalement avec le vitrobot. Bien que le complexe soit visible en coloration négative, lors du passage en condition cryogénique, quasiment aucune particule du complexe ne peut être identifié sur les images réalisées que ce soit dans de la glace fine ou de la glace épaisse (Figure 52). De plus, l’association d’un gradient de type GraFix au gradient GraDeR n’entraine aucune modification et n’améliore pas la visibilité du complexe. Une importante dissociation est néanmoins observée même en présence d’agent de pontage, la concentration utilisée n’est peut-être donc pas suffisante.
La concentration utilisée étant supérieure, on devrait pouvoir observer une amélioration dans la distribution des particules et en identifier plus dans les trous des grilles. Les expériences présentées ici, m’ont permis d’identifier que les modifications de type gradient, de quantité de complexes, la réticulation, n’avaient pas un impact important sur la distribution des particules. J’ai donc décidé d’utiliser de nouvelles grilles présentant une fine couche de carbone continue. Cette méthode permet d’adsorber le complexe protéique sur le film de carbone. Ainsi, si l’absence de complexe au sein des trous des grilles de type R2/2 vient d’une affinité préférentielle du complexe pour le carbone, l’utilisation d’une couche continue de carbone devrait permettre de répartir uniformément le complexe sur la grille. En effet, les complexes macromoléculaires qui ont la capacité d’interagir avec l’ADN présentent une plus grande affinité pour le support et seront exclus des trous. Bien qu’extrêmement répandue, cette technique présente certaines limites ; ainsi l’utilisation de carbone va induire un bruit de fond limitant la visibilité du complexe, ce qui peut être compensé ici par la taille importante de NuRD. Mais elle peut aussi être la cause d’orientations préférentielles de nos particules.
126 Figure 52 Influence du gradient de type GraDeR A) et B) représentent la purification du complexe NuRD avec l’utilisation d’un gradient de type GraDeR suivi d’une étape d’élimination du saccharose par dessalement en A) et dialyse en B). C) et D) représentent le même type de traitement de fraction mais lors de la purification un gradient de type GraFix associé à un GraDeR est réalisé.
A) B)
127
GATAD2A/B ≈ 68kDa HDAC 1/2 ≈ 55kDa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20