Les grilles de carbone continu ont été réalisées à partir de grilles commerciales R2/2 avec la méthode du carbone flotté. Lors du dépôt de l’échantillon, comme pour les précédentes expériences l’échantillon a été déposé en deux fois (3 µL à chaque fois) avec un temps d’incubation d’environ 5-10 minutes lors du dépôt de la première goutte pour laisser le temps au complexe de se déposer sur la grille par gravité. Néanmoins, il est important de ne pas laisser l’échantillon trop longtemps lors de cette incubation. L’incubation de gouttes de 3 µL va augmenter le contact à l’interface air-tampon et aboutir à la dissociation du complexe. Au vu de l’importante dissociation du complexe, j’ai décidé d’augmenter la concentration d’agent de réticulation (0.15% L-glutaraldéhyde dans la partie à 35% de saccharose) et de détergent pour le GraDeR (0.03% de DDM dans la partie à 15% de saccharose). Pour ne pas endommager la couche de carbone, la décharge luminescente a été réduite à 15 secondes.
Figure 53 Analyse par électrophorèse SDS-PAGE de NuRD. 1 et 2 : les fractions d’élution des fractions insolubles et soluble. 4 à 20 les fractions post-gradient de saccharose de la fraction insoluble.
Différentes grilles ont pu être réalisées avec les fractions 15 et 16 observées sur le gel SDS comme étant caractérisées par l’ensemble des sous-unités, puis observé sur le Polara à une tension d’accélération de 300 kV. Pour cette analyse, un défocus de -5 µm et un grandissement de 59000x ont été utilisés avec la caméra Falcon I.
L’utilisation des grilles en carbone continu, nous permettent de repérer plus de particules que précédemment.
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Figure 54 micrographes de la fraction insoluble ENI. A), B) et C) On peut observer sur ces trois micrographes la présence de particules encadrées en jaune, en violet sont encadrés les particules de formes allongés pouvant être le complexe débobiné et en orange les particules circulaires. Enfin, en bleu sont encadrés les agrégats. E) En vert sont pointé les sous-unités dissociées avec un diamètre
A) B) C) D) 50 nm 18 nm 18 nm 18 nm 50 nm Zoom : E) E)
129 inférieur à 10 nm. La ligne bleue sert de barre d’échelle pour l’agrégat et en mauve pour la particule allongée dissociée. En rouge sont caractérisées les particules d’environ 20 nm.
On observe principalement des particules longilignes qui attestent de l’instabilité et de la flexibilité importante du complexe (Figure 54). De plus, on constate, que le complexe s’agrège encore énormément sur les grilles. Pour résoudre ce problème d’agrégation de nombreuses modifications de tampon, dans le but de changer la force ionique et ainsi limiter ce problème ont pu être testé. Le tableau 5 illustre les différentes conditions testées. Malgré tous ces efforts, aucune réelle amélioration n’a été observée.
Tampon et pH
Sel MgCl2 EDTA Agent
réducteur Détergent Glycérol HEPES pH 7,65 HEPES pH 8,0 HEPES pH 8,5 CHES pH 9,0 150 mM NaCl 125 mM NaCl 100 mM KCl 80 mM KAcO 100 mM KAcO 3 mM 0.1 mM 0 mM DTT 1 mM TCEP 0.5 mM DDM 0.005 à 0.0004% 0 à 1%
Tableau 5 Résumé des conditions testées sur grilles en carbone continu.
L’intérêt majeur dans ces changements de sels ou de pH est d’essayer de réduire l’agrégation est également de stabiliser le complexe. Les protéines sont théoriquement moins solubles lorsque leur pH est égal au pI ; dès lors changer le pH va changer la charge nette des protéines et la répartition des charges en surface. En plus d’avoir une influence sur l’agrégation, le changement de charge devrait influencer directement la répartition des particules sur la grille. Aucun effet direct lors des changements de pH ne fut néanmoins observé.
Les changements de sels et de concentration de sel vont avoir un effet quant à eux sur la force ionique. En modifiant la force ionique, on modifie les interactions électrostatiques au sein des protéines et entre les protéines. Ces modifications peuvent stabiliser ou déstabiliser nos échantillons et donc prévenir ou être la cause d’agrégations. Le changement de type de sel peut affecter également la stabilité de l’échantillon, par l’incorporation d’ions qui vont pouvoir interagir avec les protéines. De la même façon qu’avec les variations de pH, aucune véritable amélioration ne fut observée.
130 Néanmoins, toutes ces modification ont été réalisé par la technique de dessalement après le gradient saccharose réalisé avec un tampon de type HEPES pH 8,0 et 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM TCEP, 1% glycérol et 0.005% DDM. Il serait intéressant de
réaliser ces changements lors de la purification, durant l’étape du gradient de densité.
Figure 55 Analyse par électrophorèse SDS-PAGE de NuRD. Fraction soluble
Pour la fraction soluble (Figure 56), on observe la présence de complexe en A) et B). De même que pour la fraction insoluble, les particules semblent allongées. La réticulation avec le glutaraldéhyde ne semble pas optimale ; en effet, lors de l’observation de fractions en amont de celles étudiées on observe une importante agrégation des particules. Le composé de réticulation peut-être trop concentré ou la méthode de GraFix entraîne une réticulation trop longue qui ponte toutes les sous-unités de façon intermoléculaire. Les expériences précédentes avec cette fraction ont montrés que la diminution de cet agent entraînait la dissociation du complexe lors de la congélation. J’ai donc décidé ici de tester un autre agent de réticulation plus spécifique que le glutaraldéhyde, le BS3. Le bras liant les deux fonctions réticulantes de ce composé mesure environ 11 Å, bien plus long que la glutaraldéhyde. De ce fait, le BS3 est capable de ponter des composés plus éloignés au sein du complexe et peut-être stabiliser l’intégralité de NuRD. Il est nécessaire de contrôler très finement la concentration de ce composé qui pourra ponter différents complexes à plus grande distance. Le BS3 est de plus non adapté la méthode de GraFiX, tous les tests réalisés avec cet agent ont été réalisés à la suite du gradient de saccharose.
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Figure 56 micrographes de la fraction insoluble ENS. A), B) et C) On peut observer sur ces trois micrographes la présence de particules encadrées en jaune. En rouge sont encadrés les agrégats. Ces fractions ont été traitées par dessalement pour éliminer le saccharose. D) fraction 9, cette fractions en amont des fractions ou s’équilibre le complexe, est composée de complexe agrégés de façon irréversible. E) grandissement des particules observées. Les formes des particules observées ici sont très similaires à celles observées en coloration négative en Figure 51 et pourraient représenter différentes orientation du complexe NuRD.
A) B) C) D) 18 nm 18 nm E) 18 nm 20 nm
132 Figure 57 Comparaison des formes observées en coloration négative (images encadrées en rouge) et celles observées en cryo-EM. On retrouve dans les deux échantillons des particules similaires en formes et en tailles.
Comme on peut l’observer en Figure 57, bien que la réticulation fut trop importante on observe des particules de taille et formes similaires que l’on a pu identifier également précédemment au cours des différents tests réalisés. Ces observations sont en accord avec celles déjà observée en coloration négative et mettent en avant une organtisation en domaines du complexe NuRD.
Une acquisition sur le Titan Krios par les Dr. Ottilie Loeffelholz Von Colberg et Dr. Brice Beinsteiner a été quand même envisagée, mais la grille a été perdue lors de son chargement dans le microscope. 18 nm 17 nm 18 nm 20 nm 17 nm 18 nm 20 nm 16 nm 16 nm 18 nm
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