Valores (totais e média/colheita) semelhantes quanto ao número total de estruturas recuperadas, de embriões degenerados e de embriões viáveis, obtidos através da lavagem uterina, foram observados nas três categorias de doadora avaliadas. De forma semelhante, outros estudos também não identificaram diferença entre vacas lactantes e não lactantes (HASLER et al., 2006) ou novilhas (LEROY et
al., 2005).
No entanto, diferentemente do que foi observado no presente estudo, um trabalho realizado nos EUA (Vale São Joaquim, Califórnia; CHEBEL et al., 2008), no qual foram colhidos dados de duas propriedades leiteiras, durante julho de 2006 a junho de 2007, mostrou diferença na produção total de estruturas e embriões viáveis entre vacas em lactação (6,77; 3,62 e n = 309) e vacas não lactantes (14,14; 5,44 e n = 359; P < 0,01). Nesse mesmo estudo, foi encontrado também efeito de época do ano, sendo as estações mais quentes associadas a menor produção de embriões viáveis, o que também vai contra os resultados ora apresentados. Apesar da contradição de dados entre o presente estudo e o realizado por CHEBEL et al. (2008), é importante destacar que no experimento mencionado, tanto doadoras lactantes quanto não lactantes foram submetidas ao mesmo protocolo superovulatório (bastante semelhante ao descrito para as vacas não lactantes no
presente experimento, mas utilizando cio “base”), no qual o GnRH foi administrado 48 horas após a aplicação de PGF2, o que pode ter prejudicado o desempenho das
doadoras em lactação. Sabe-se que vacas lactantes possuem metabolismo elevado, o que causa ovulação atrasada e justificaria, portanto, a utilização do protocolo modificado descrito no atual estudo, com atraso de 12 horas no início das aplicações de FSH e GnRH 60 horas após a PGF2. Essa afirmativa é apoiada por estudos
brasileiros que confirmam a hipótese que, em doadoras Holandesas em lactação superestimuladas, o atraso da indução da ovulação aumenta as taxas de ovulação por permitir um aumento do diâmetro folicular e da capacidade ovulatória no momento da administração de LH (BARUSELLI et al., 2005; MARTINS et al., 2005; RODRIGUES et al., 2005). Em um desses estudos, realizado por MARTINS et al. (2005), vacas que receberam LH 48 horas após a PGF2 tiveram desempenho
bastante inferior em número de embriões transferíveis (2,3 ± 0,5 vs 4,9 ± 0,9) e congeláveis (2,1 ± 0,5 vs 4,7 ± 0,9) além de apresentarem maior dispersão das ovulações (17,5 ± 2,3 vs 10,9 ± 2,0h entre a primeira e última ovulação) quando comparadas aos animais tratados com LH 60 horas após o agente luteolítico, respectivamente. Novamente, esses dados corroboram com a redução numérica de estruturas e embriões viáveis observados por CHEBEL et al. (2008) e justificam a diferença encontrada nos resultados desses autores e os obtidos no presente experimento. Além disso, não se deve esquecer que o uso de implante de progestágeno para a sincronização da onda de crescimento folicular pode ter sido responsável por uma melhora no desempenho das doadoras do presente trabalho, aproximando os resultados em termos de estruturas colhidas entre vacas não lactantes e lactantes.
Alguns trabalhos também apresentam uma comparação do desempenho à SOV e lavagem uterina entre gado de leite e corte. Em um deles, vacas leiteiras em lactação produziram menor quantidade de oócitos/embriões (estruturas totais) do que vacas de corte (PUTNEY et al., 1988). Esse resultado evidencia o comprometimento reprodutivo de vacas em lactação, o qual deve estar relacionado ao seu metabolismo bastante acelerado, resultando, consequentemente, em índices reprodutivos inferiores aos encontrados para animais de corte.
Outro resultado encontrado no presente estudo foi a ocorrência de menor número de oócitos NF por colheita na categoria das novilhas (0,94 ± 0,23) em relação às vacas não lactantes (5,39 ± 0,87; P = 0,001) e lactantes (7,37 ± 1,63; P = 0,002; Tab.9). Estudos avaliando a taxa de concepção em grandes rebanhos leiteiros comerciais mostram que a fertilidade de novilhas (> 60%) parece ser bastante superior à encontrada em vacas (25 a 40%), reforçando os resultados encontrados no presente experimento (BUTLER, 2008a).
Inesperadamente, maior taxa de concepção aos 25 dias foi obtida em receptoras cujos embriões foram provenientes de doadoras em lactação (44,2%) quando comparados aos provenientes de novilhas (29,8; P = 0,02). Embriões de doadoras em lactação também resultaram maior taxa de concepção aos 46 dias (37,6%), com relação tanto a novilhas (23,4%; P = 0,009), quanto a doadoras não lactantes (25,3%; P = 0,02). Ainda, menor perda gestacional (15,1%) foi relacionada às doadoras em lactação, quando comparadas às doadoras não lactantes (38,3%; P = 0,01; Tab.10). Contradizendo os resultados ora encontrados no seguinte projeto, diversos trabalhos já acima mencionados mostram eficiência reprodutiva inferior quando do uso de embriões de vacas lactantes. As possíveis explicações para essa inesperada superioridade dos embriões provenientes de vacas em lactação encontrada no presente estudo residem em 4 aspectos principais: nutrição, DEL, bem-estar animal e utilização de bST.
a) Nutrição
Quanto à nutrição, é importante ressaltar que na propriedade em que foi realizado esse estudo, as vacas não lactantes receberam rotineiramente a mesma ração que é formulada para vacas em lactação, ou seja, receberam quantidade de nutrientes bastante superior à exigida para sua mantença. Sabe-se que o alto consumo de matéria seca provoca aumento do metabolismo de estradiol (SANGSRITAVONG et al., 2002), hormônio essencial para a fertilização (MANN & LAMMING, 2000). A redução das concentrações de estradiol também está associada à formação de folículos persistentes, o que leva a diminuição da qualidade oocitária (WILTBANK et al., 2006) e comprometimento do desenvolvimento embrionário (MANN & LAMMING, 1999). Além disso, estudos mostram que a ingestão de dietas
com alto nível protéico pode ser prejudicial ao desempenho reprodutivo dos animais, podendo levar a alterações no fluido folicular, ambiente uterino e/ou desenvolvimento embrionário e, consequentemente, redução na taxa de concepção (BUTLER, 2008b), como descrito a seguir:
A concepção e o estabelecimento da concepção dependem de uma progressão ordenada de eventos e processos inter-relacionados que ocorrem dentro do trato reprodutivo: desenvolvimento folicular resultando em ovulação, fertilização do oócito, transporte e desenvolvimento do embrião, reconhecimento materno e implantação do embrião. A amônia, uréia ou outro subproduto tóxico do metabolismo das proteínas podem interferir em um ou mais desses passos, comprometendo a eficiência reprodutiva (BUTLER, 2008b). Dessa forma, as medidas de nitrogênio uréico plasmático (PUN) e no leite (MUN) têm fornecido um índice bastante útil para o estudo da associação entre o metabolismo da proteína da dieta e a eficiência reprodutiva. Em muitos trabalhos, aumentos nas concentrações de PUN e MUN foram correlacionados à menor fertilidade de vacas leiteiras tanto em confinamento quando mantidas a pasto (BUTLER, 1998; WESTWOOD et al., 1998; TAMMINGA, 2006; WITTWER et al., 1999). Nesse contexto, as taxas de concepção diminuiram cerca de 20% quando o PUN ou o MUN eram > 19 mg/dL (BUTLER et al., 1996). Ainda, mais recentemente, um amplo estudo de campo sugeriu que a taxa de concepção pode ser reduzida mesmo com níveis de MUN mais baixos (>15,4 mg/dL; RAJALA-SCHULTZ et al., 2001). Esses resultados sugerem a ocorrência de alterações metabólicas ligadas ao alto consumo protéico que podem estar causando menor fertilidade das doadoras não lactantes do presente estudo.
Quando estudos mais específicos envolvendo alterações em fluido folicular e ambiente uterino são considerados, os efeitos negativos do excesso de proteína na dieta ficam ainda mais evidentes. HAMMON et al. (2005) demonstraram que os níveis de uréia e amônia encontrados no fluido folicular estavam direta e positivamente relacionados aos níveis de PUN, confirmando os resultados que foram encontrados em um estudo em que novilhas alimentadas de forma a gerar altos níveis de amônia no rúmen apresentaram altos níveis de amônia no fluido folicular (SINCLAIR et al., 2000). Ainda, os oócitos colhidos dessas mesmas novilhas tiveram
taxas de clivagem menores que dos animais do grupo controle (dieta gerando baixos níveis de amônia), o que mostra uma influência negativa da proteína em excesso no desenvolvimento embrionário e mais uma vez pode explicar as taxas obtidas por doadoras não lactantes superalimentadas no presente trabalho.
O alto consumo de proteína também alterou as concentrações de minerais nas secreções uterinas durante a fase lútea (JORDAN et al., 1983), o nível de amônia no fluido uterino (HAMMON et al., 2005) e o pH uterino ao longo do ciclo estral (ELROD & BUTLER, 1993; ELROD et al., 1993). Normalmente, o pH uterino aumenta de cerca de 6,8 ao estro para 7,1 no dia 7 do ciclo estral (fase lútea), mas esse aumento não foi observado em vacas lactantes e novilhas alimentadas com dietas ricas em proteína. Os resultados desses estudos sugerem que o aumento dos níveis de uréia devido a utilização de uma dieta rica em proteína pode reduzir a fertilidade por interferir com os efeitos da progesterona sobre o microambiente uterino, proporcionando dessa forma condições sub-ótimas para manter o desenvolvimento do embrião (BUTLER, 2001). Apesar de, no presente estudo, os embriões permanecerem pouco tempo em contato com o ambiente uterino das doadoras, este se mostra muito importante e pode estar exercendo alguma influência sobre o desenvolvimento embrionário inicial, o que pode ter levado às reduzidas taxas de concepção aos 46 dias e altas taxas de perda gestacional verificadas.
Mais recentemente, um estudo de RHOADS et al. (2006) em vacas leiteiras mostrou a grande influência do alto PUN do desenvolvimento embrionário precoce (enquanto ainda nas doadoras). Nesse trabalho, as taxas de concepção observadas foram mais baixas nas receptoras que receberam embriões recuperados de vacas de PUN alto em relação às doadoras de PUN moderado (11 e 35%, respectivamente). Esses resultados indicam que os efeitos prejudiciais do PUN elevado ocorrem antes do dia 7 após a IA e podem ser direcionados ao desenvolvimento dos oócitos nos folículos ovarianos ou a aspectos do desenvolvimento embrionário no oviduto e útero. Esse dado fortalece, e muito, a hipótese ora criada de que a alimentação excessivamente rica em proteínas pode ter sido uma grande responsável pelas baixas taxas de concepção das receptoras que foram inovuladas com embriões provenientes de vacas não lactantes superalimentadas no presente experimento.
Ainda, os efeitos negativos da superalimentação podem ser mediados por alterações endócrinas como a hiperinsulinemia e o aumento da glucose e IGF-1, o que pode interferir com o transporte de glicose no embrião e intensificar a apoptose (SANTOS et al., 2008; SARTORI et al., 2007; Figura 18).
INGESTÃO DE ALIMENTO
Muito baixa
Baixa
Alta
Muito alta
Anestro
Subfertilidade
P4
E2
IGF-I
Qualidade
- Ovócitos
- Embriões
Tamanho e
quantidade de
folículos
P4
E2
IGF-I
Qualidade
- Ovócitos
- Embriões
Tamanho e
quantidade de
folículos
Ondas
foliculares
no ciclo
Ondas
foliculares
no ciclo
INGESTÃO DE ALIMENTO
Muito baixa
Baixa
Alta
Muito alta
Anestro
Subfertilidade
P4
E2
IGF-I
Qualidade
- Ovócitos
- Embriões
Tamanho e
quantidade de
folículos
P4
E2
IGF-I
Qualidade
- Ovócitos
- Embriões
Tamanho e
quantidade de
folículos
Ondas
foliculares
no ciclo
Ondas
foliculares
no ciclo
Figura 18. Esquema resumido dos possíveis efeitos de diferentes níveis de ingestão de alimentos na fisiologia reprodutiva das fêmeas bovinas. P4 = progesterona, E2 = estradiol, IGF-I = fator de crescimento semelhante à insulina (SARTORI et al., 2007)
b) DEL
Em um de seus estudos, SARTORI et al. (2002) observaram alta incidência de baixa qualidade embrionária em vacas de alta produção e no início da lactação em comparação a vacas não lactantes (2,2 +/- 0,3 vs. 3,1 +/- 0,3) e novilhas (2,2 +/- 0,3 vs. 3,8 +/- 0,4), respectivamente. Ainda, vacas em início de lactação apresentaram alta porcentagem de embriões não viáveis comparadas às vacas não lactantes. No
entanto, a média de DEL das doadoras em lactação que fizeram parte do presente projeto foi de 502,30 ± 37,22, o que mostra claramente que esses animais estavam fora do início e pico de lactação e do período de balanço energético negativo, que são grandes fatores responsáveis pela queda do desempenho reprodutivo de vacas em lactação de alta produção. Esse fato pode justificar o bom desempenho dessa categoria animal encontrado no atual experimento.
c) Bem-estar animal
Na propriedade em que o presente projeto foi desenvolvido, vacas não lactantes e novilhas (inclusive as doadoras) foram mantidas em piquetes, enquanto as vacas em lactação foram acondicionadas em galpões tipo freestall equipados com ventiladores, aspersores e camas limpas para descanso. Dessa forma, pode-se supor que as doadoras em lactação estavam em equilíbrio metabólico (item b) e ambiental bom o suficiente para que pudessem desempenhar boa função reprodutiva, como foi efetivamente observado no presente estudo ao se analisar as taxas de concepção das receptoras que receberam embriões de doadoras dessa categoria.
d) Utilização de bST
Quanto ao uso de bST, podemos especular que a utilização desse hormônio nas doadoras em lactação pode ter sido um dos fatores responsáveis por uma provável melhora na qualidade dos embriões recuperados dos animais dessa categoria e pela maior taxa de concepção encontrada nas receptoras inovuladas com esses embriões. Essa hipótese foi levantada com base em uma série de estudos a respeito dos efeitos da bST na reprodução de vacas em lactação, como relatado a seguir:
Em linhas gerais, foi mostrado que o uso de bST em associação a protocolos de sincronização da ovulação (como o Ovsynch) em animais já cíclicos, foi capaz de aumentar as taxas de concepção (MOREIRA et al., 2000), melhorar as características embrionárias e aumentar as taxas de transferência de embriões (THATCHER et al., 2001; STEVENSON, 2008). Quanto ao momento da aplicação da bST, MOREIRA et al. (2001) observaram melhora nas taxas de concepção de animais recebendo bST tanto no dia da IA quanto no início do protocolo Ovsynch (10
dias antes da IA), sendo constatado um aumento de 9% na concepção dos grupos tratados (34%) em relação ao grupo controle (sem bST, 25%). Os mesmos autores encontraram resposta ainda melhor dos animais tratados com bST, quando foi aplicada a pré-sincronização (Presynch) anterior ao protocolo Ovsynch, para os mesmos três grupos (com bST = 56 a 58% vs sem bST = 43%). Esses resultados mostram que o uso de bST, mesmo 10 dias antes da IA, já produz efeitos benéficos que resultam em melhores índices reprodutivos e que, portanto, podem explicar, de certa forma, as melhores respostas obtidas por doadoras que receberam esse hormônio no presente estudo.
Outro estudo (SANTOS et al., 2004) testou o uso de bST em vacas em lactação, cíclicas, de primeiro serviço e mostrou que os animais tratados com esse hormônio apresentaram maior taxa de concepção aos 45 dias pós-IA (53%) do que os não tratados (40%). Os autores também observaram que o tratamento com bST reduziu as perdas de concepção após a primeira IA, resultado que reforça os obtidos no presente trabalho, já que as perdas observadas em receptoras que receberam embriões provenientes de doadoras submetidas a aplicação de bST (vacas em lactação) foram inferiores às relativas a doadoras que não foram tratadas (vacas não lactantes).
Mais além, um experimento conduzido para determinar o efeito da bST sobre o desenvolvimento de embriões de doadoras superovuladas (THATCHER et al., 2001) mostrou que o tratamento das vacas com bST aumentou as taxas de fertilização (menor número de oócitos NF), a porcentagem de embriões transferíveis ou congeláveis e acelerou a maturação embrionária (maior número de embriões na fase de blastocisto). No presente experimento não foi observada diferença no número de oócitos NF e embriões viáveis entre as doadoras que receberam ou não bST. No entanto, é muito importante ressaltar que os animais tratados ou não eram de categorias diferentes (vacas em lactação e vacas não lactantes/novilhas, respectivamente), o que inviabilizaria essa comparação. Provavelmente, se tivéssemos um grupo de doadoras em lactação que não recebesse a bST, os resultados seriam semelhantes aos encontrados pelo grupo de THATCHER, ou seja, seria observada uma melhora de fertilidade nos animais recebendo esse hormônio.
Dessa forma, podemos supor que a bST melhorou sim os índices relativos aos oócitos e embriões das vacas em lactação do presente estudo, deixando-as inclusive, semelhantes as vacas não lactantes e novilhas em termos de número de embriões viáveis.
Essa especulação ganha ainda mais força quando os resultados da segunda fase experimental do trabalho acima mencionado (THATCHER et al., 2001) são levados em consideração. Nessa fase, observou-se que entre receptoras Holandesas em lactação que não receberam bST, a transferência de embriões provenientes de doadoras tratadas com bST aumentou a taxa de concepção em comparação à TE de doadoras não tratadas (56 vs 26%), demonstrando a influência positiva desse hormônio sobre a qualidade dos embriões produzidos por doadoras tratadas. Além disso, esses autores mostraram que, independentemente da fonte de embriões, a taxa de concepção das receptoras tratadas com bST um dia após o estro e, posteriormente, a cada 14 dias (43%) foram mais elevadas que a de receptoras controle que receberam embriões provenientes de doadoras controle (sem bST; 26%). Esse manejo de receptoras (bST a cada 12 dias) foi também adotado no presente estudo, uma vez que demonstra ser benéfico para a fertilidade, além de aumentar a produção de leite.
Quanto ao uso de bST em vacas não lactantes, um trabalho realizado por BILBY et al. (2004) mostrou redução das taxas de prenhez quando esse hormônio foi utilizado em animais dessa categoria (bST = 27.2% vs sem bST = 63.6%), resultado que dá suporte para os obtidos no presente projeto. Neste mesmo trabalho prévio foi observado maior tamanho do concepto e maior quantidade total de interferon-tau no lavado uterino dos animais tratados com bST, bem como tendência de maior peso do CL desse grupo, o que em um primeiro momento contrasta com os resultados de prenhez. No entanto, os autores sugerem que, nas vacas não lactantes, a bST deve ter hiperestimulado o IGF-1 e a insulina plasmática, causando assincronia entre concepto e útero, o que foi prejudicial à prenhez.
Outro aspecto relacionado à bST que não deve ser ignorado é que o veículo utilizado para carrear esse hormônio (forma comercial utilizada – Boostin® 10) é a
vitamina E (1.655 UI, nesse caso), a qual possuí ação antioxidante que pode ter auxiliado ainda mais o desempenho das doadoras em lactação. Além disso, é importante ressaltar que, como já foi mencionado, todas as receptoras receberam aplicações regulares (a cada 14 dias) de bST, o que pode ter mascarado a ação antioxidante esperada com o uso do Trolox®.
De maneira geral, os resultados acima indicam que a bST pode elevar as taxas de concepção de vacas leiteiras em lactação ao aumentar as taxas de fertilização, acelerar o desenvolvimento embrionário precoce e afetar fatores nas vacas prenhes que estimulam o desenvolvimento do embrião (STEVENSON, 2008), o que pode de certa maneira explicar os melhores índices alcançados pelas receptoras que receberam embriões das doadoras em lactação, nas quais foi usado a bST.
7.1.3. Estádio e Qualidade Embrionária e Sincronia do cio entre