Les programmes 7_select_on_cov et 8_ident_SV

II.1.2 Les programmes 7_select_on_cov et 8_ident_SV

Ces deux programmes constituent le coeur du pipeline puisque que ce sont ces programmes qui identifient les paires de zones discordantes (7_select_on_cov) et déduisent de l’analyse de ces paires de zones discordantes identifiées des variations structurales (8_ident_SV). Il m’a donc semblé important de décrire plus en détail leur principe et fonctionnement.

Le programme 7_select_on_cov qui recherche des paires de zones discordantes travaille indépendamment sur chaque fichier contenant les lectures discordantes triées par le programme 6_parse_discorde et s’exécute en cinq étapes :

(i) La couverture des lectures triées sur leur configuration d’alignement sur le génome de référence est calculée.

(ii) Des zones de discordance sont ensuite identifiées sur la couverture avec les critères suivants (Figure 20) : une zone est définie si elle présente au moins X sites couverts avec pas plus de Y sites contigus non couverts. La zone identifiée n’est pas conservée si la couverture médiane des sites couverts n’est pas comprise entre des valeurs de couvertures minimales (mini) et maximales (maxi). Ce seuil de couverture maximale permet d’éliminer en théorie les séquences répétées (très couvertes) qui risquent de créer un bruit important dans l’analyse. Le seuil de couverture minimale ainsi que la taille minimale de la zone permettent d’éliminer les faux positifs liés à des problèmes d'alignement des lectures.

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Figure 21 : Schématisation de l’identification de la zone de destination d’une zone de discordance correspondant à la troisième étape du programme 7_select_on_cov. Les lectures pairées (lien vert) dont une des sœurs entre dans la zone de destination déjà identifiée par les lectures pairées est conservée pour définir cette zone. La lecture pairée (lien rouge) dont une des sœurs s’aligne dans la zone de discordance mais la seconde sœur ne s’aligne pas dans la zone de destination sera utilisée pour rechercher une autre zone de destination. La valeur W est égale à la taille de la zone de discordance auquel est ajoutée une valeur égale à 3*(écart type de la taille d’insert). Zone de discordance Zone de destination W W médiane

Lecture pairée utilisée pour définir une autre zone de destination

Lecture pairée rentrant dans la zone de destination et conservée pour cette zone

155 (iii) Pour chacune des zones de discordance identifiées en (ii), les lectures sœurs des lectures s’alignant dans une zone de discordance sont utilisées pour identifier une ou des zones de destinations. Comme une zone de discordance peut avoir plusieurs zones de destinations, ces zones de destinations sont identifiées en suivant une approche itérative qui attribue les lectures de destination aux différentes zones possibles de destination (Figure 21). Cette approche consiste en une première étape qui prend aléatoirement une des lectures discordantes s’alignant dans la zone de discordance et à attribuer comme première zone de destination la position de sa lecture sœur. L’étape d’itération consiste à ajouter successivement des lectures sœurs de celles s’alignant dans la zone de discordance afin de mieux définir les limites de cette zone de destination. La validation de l’appartenance de lectures sœurs à la zone de destination est effectuée si celles-ci s’alignent dans une zone comprise autour de la médiane des positions des lectures sœurs déjà attribuées à la zone, plus ou moins une valeur W. Cette valeur W est égale à la taille de la zone de discordance à laquelle est ajoutée une valeur Z = 3*(écart type de la taille “d’insert”). Si aucune lecture sœur supplémentaire ne peut être attribuée à la zone de destination, la recherche d’une nouvelle zone de destination est effectuée jusqu’à attribution de toutes les lectures sœurs des lectures s’alignant dans la zone discordante. Les limites des zones de destination et leurs zones de correspondance sont recalculées et filtrées sur les critères X, mini et maxi définis en (ii).

(iv) Les paires de zones identifiées de même type et adjacentes sont ensuite regroupées. Pour que deux paires de zones adjacentes soient regroupées, il faut qu’elles présentent le même type de discordance et que leurs zones de discordances et zones de destinations soient chacune suffisamment proches. La valeur de proximité est fournie par l’utilisateur sous forme d’un entier correspondant au nombre de bases maximum accepté entre les deux zones de discordances et les deux zones de destinations.

(v) Un score est ensuite appliqué aux paires de zones identifiées en se basant sur la moyenne des tailles d’une paire de zone de discordance et de destination et sur la couverture médiane par les lectures discordantes de ces zones. Le score est calculé de la façon suivante :

𝑆𝑐𝑜𝑟𝑒 = 100 ∗ 𝑓(𝑐𝑜𝑢𝑣𝑒𝑟𝑡𝑢𝑟𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎𝑛𝑒) ∗ 𝑔(𝑡𝑎𝑖𝑙𝑙𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑧𝑜𝑛𝑒) 𝑓(𝑥) = {

1

𝑎^{∗ 𝑥 (𝑠𝑖 𝑥 < 𝑎)} 1 (𝑠𝑖 𝑥 ≥ 𝑎)

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Figure 22 : Schématisation de la détection des bornes d’une inversion. Seules les lectures

pairées (flèches) qui chevauchent le point de réarrangement (trait vertical rouge) permettent d’identifier l’inversion, ce qui conduit à l’identification de deux paires de zones discordantes. Ces zones font au maximum la taille maximale des séquences de la banque.

Accession re-séquencée

Génome de référence Inversion

Détection de lectures discordantes uniquement aux points de réarrangements Taille de la banque

157 𝑔(𝑥) = {

1

𝑏^{∗ 𝑥 (𝑠𝑖 𝑥 < 𝑏)} 1 (𝑠𝑖 𝑥 ≥ 𝑏)

Avec a, la valeur minimale de couverture pour que f(x) soit égale à 1 et b, la valeur minimale de la taille d’une zone de discordance pour que g(x) soit égale à 1.

Le score obtenu pour chaque zone est compris entre 0 et 100. Seules les zones ayant un score supérieur à un seuil fixé par l’utilisateur sont conservées pour la suite du pipeline. Les paramètres X, Y, mini, maxi, Z, a, b sont des options du programme. Ces paramètres permettent de s’adapter au jeu de données à disposition (taille de “l’insert” attendue, couverture, divergence avec la séquence de référence, qualité de la séquence de référence, orientation attendue des lectures) en jouant sur la taille minimale de la zone de discordance détectée, la présence ou non d’interruptions dans la zone de discordance, le nombre minimal de lectures pour valider une zone et le score des zones détectées.

Le programme 8_ident_SV recherche parmi les paires de zones discordantes identifiées la signature de variations structurales. Ce programme se base sur le principe que la recherche de variations structurales de grande taille en utilisant des données de re-séquençage, ne permet de détecter des lectures pairées discordantes qu’au niveau des points de réarrangements (Figure 22) et, plus précisément, sur une zone de la taille “d’insert” de la banque. Pour chaque type de variations structurales, on peut identifier des configurations de paires de zones discordantes typiques (signatures). Ce sont ces signatures que le programme 8_ident_SV recherche. L’ensemble des signatures recherchées par le programme 8_ident_SV et les figures Circos attendues sont présentées en Annexe 1. Ce programme recherche les déletions, les inversions, les duplications simples ou inversées et les translocations simples ou réciproques avec inversion ou non des régions transloquées. Les duplications et translocations sont recherchées à la fois au niveau intra- et inter-chromosomique. En cas de variations structurales situées à l’extrémité d’un chromosome, les signatures sont partielles et ne sont donc pas directement identifiées par ce programme 8_ident_SV. Par contre, les lectures discordantes et les zones de discordance que ces variations engendrent sont visualisables sur les figures Circos générées par le programme draw_circos.

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Figure 23 : Représentation Circos simplifiée des paires de zones discordantes identifiées par le pipeline de recherche de variations structurales avec la banque de 5 kb obtenue par re-séquençage de l’accession ‘Pahang’.

Scaffolds non

ancrés aux 11

chromosomes

chr05

chr02

chr03

chr04

chr06

chr08

chr07

chr09

chr01

chr10

chr11

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II.2 Test du pipeline sur l’accession ‘Pahang’ en utilisant comme référence la version