IV. Les transporteurs ABC
2. Les P-glycoprotéines (Pgps)
Les Pgps sont phosphoglycoprotéines localisées dans la membrane cytoplasmique et
constituées d’une seule chaine polypeptidique d’environ 1300 acides aminés. La masse
moléculaire de la protéine mature varie entre 130 kDa et 180 kDa. Cette différence est
essentiellement liée à la glycosylation. Ces pompes sont composées de deux TMD de 6 segments
transmembranaires chacune et de 2 domaines NBD (Figure 5).
Figure 5: Organisation structurale des P-glycoprotéines. Vue de devant (A) et de
derrière d’une Pgp.
Les segments transmembranaires (TM1 à 12 sont représentés. La moitié N-terminale
et C-terminale sont colorés en jaune et bleu respectivement. La barre représente la
a) Caractéristiques fonctionnelles et structurales des Pgps
Une des principales caractéristiques des Pgps est leur capacité à transporter des substrats
très variés grâce à l’énergie fournie par hydrolyse de l’ATP (Figure 6).
Figure 6 : Modèle de transport de substrat par les P-glycoprotéines d’après Aller et
al, 2009.
Fixation du substrat (rose) et de deux molécules d’ATP (jaune) (A). Hydrolyse des deux
molécules d’ATP et efflux du substrat (B).
Les substrats transportés par les Pgps incluent des médicaments anticancéreux [88], des
hormones stéroïdiennes, des lipides, des antiviraux, des peptides, des pesticides et des molécules
anthelminthiques.
segment transmembranaire (TM) 4 et 6 et la seconde dans le TMD2 de la partie C-terminale entre
le TM11 et le TM12 [89, 90]. La mise en évidence de la sélectivité des sites de fixation des
substrats a été réalisée par Shapiro et Ling [91] grâce à l’identification de la coopérativité entre la
rhodamine 123 (R123, site R) et le Hoechst 33342 (H33342, site H). Les substrats des Pgps
peuvent être classés en trois groupes basés sur leurs interactions avec la R123 et le H33342. Les
molécules de classe 1 stimulent le transport de la R123 et inhibent le transport du H33342
(colchicines, quercétine par exemple), les molécules de classe 2 stimulent le transport du H33342
et inhibent celui de la R123 (anthracyclines par exemple) et enfin les molécules de classe 3
inhibent le transport du H33342 et de la R123 (vinblastine, actinomycine D par exemple) [91].
Plus récemment, d’autres études ont montré que certaines molécules telles que la prazosine et la
progestérone peuvent stimuler simultanément le transport de la R123 et du H33342, suggérant
l’existence d’un troisième site de fixation [92].
b) Les P-glycoprotéines et la résistance aux xénobiotiques
L’importance de ces transporteurs membranaires comme modulateurs de l’effet
cytotoxique des xénobiotiques a été suggéré par le phénomène de résistance multiple aux drogues
anti-cancéreuses [93]. Les Pgps qui sont surexprimées à la surface des cellules cancéreuses,
empêchent l’accumulation des médicaments à l’intérieur des tumeurs et transportent vers le
milieu extérieur les médicaments, aboutissant à la résistance des cellules cancéreuses aux
drogues. Ce mécanisme de résistance est impliqué dans d’autres échecs thérapeutiques tels que
les traitements anti-VIH par des inhibiteurs de protéases [94]. Les Pgps sont aussi impliquées
dans le transport de molécules antimicrobiennes et sont responsables des résistances croisées aux
médicaments chez les microorganismes d’importance médicale ou agronomique majeur [95, 96].
Ce mécanisme de détoxication remet en cause l’efficacité de nombreux traitements contre les
pathologies infectieuses. La capacité des nématodes parasites à développer des résistances
croisées à l’encontre de molécules possédant des cibles pharmacologiques très distinctes, a
suggéré l’implication des processus de détoxication non spécifiques faisant appel aux Pgps.
Chez les nématodes, 60 gènes codant des transporteurs ABC ont été identifiés chez C.
elegans. Ces transporteurs ABC ont été classés en 7 sous-familles [85]. Les Pgps sont regroupés
dans la sous-famille des ABCB. Chez C. elegans cette sous-famille est représentée par 15 gènes
dont un pseudo-gène. L’analyse de l’expression des ARNm des Pgps, l’analyse de l’activité des
transporteurs et l’utilisation de modulateurs représentent les principales méthodes utilisées pour
étudier ces pompes et leur implication dans la résistance aux drogues. Chez C. elegans l’étude
réalisée sur des souches mutantes pour les Pgp-1 et Pgp-3 ont montré l’implication de ces
transporteurs dans la résistance à des toxines bactériennes et à des médicaments [97].
Gène Fonction Localisation
Pgp-1 Défense contre des toxines bactériennes Intestin et pharynx
Pgp-2 Stockage des lipides et formation de
lysosome intestin
Pgp-3 Défense contre des toxines bactériennes Intestin, cellules
sécrétrices
Pgp-5 Résistance aux métaux lourds intestin
Tableau 2 : Fonction et localisation des P-glycoprotéines du nématode modèle C.
elegans.
A l’heure actuelle, très peu de Pgps ont été décrites chez les nématodes parasites.
Cependant des Pgps homologues à celles des mammifères ont été observées chez H. contortus.
Ces transporteurs ont été localisés au niveau de la coque, de la cuticule et de l’intestin des stades
libres et parasitaires d’H. contortus par immunolocalisation en utilisant un anticorps murin
anti-mdr1 humaine [98]. Une surexpression de la Pgp-2 d’H. contortus a été observée chez un isolat
sélectionné par l’ivermectine en comparaison de l’isolat parental sensible [95]. L’association
entre la modification de l’activité des Pgps et la résistance à l’ivermectine a aussi été observée
chez ce même parasite. D’autre part, l’implication des Pgps dans la résistance aux
anthelminthiques a été démontrée grâce à des études fonctionnelles du transport de ces molécules
par les Pgps présentes dans les coques des œufs des nématodes notamment par l’induction des
Pgps en présence des substrats [12, 99].
c) Interaction entre les pompes et les mécanismes immunitaires de
l’hôte
Au-delà de leur implication dans le transport de nombreux xénobiotiques, leur rôle dans le
transport des produits biologiques, et notamment des produits du système immunitaire, est bien
établi.
Chez les mammifères les Pgps sont exprimées au niveau des membranes apicales des
cellules ayant des fonctions excrétoires telle-que : le foie, les reins, l’intestins, la barrière
hématoencéphalique ou encore les cellules hématopoïétiques. La distribution de ces protéines
suggère un rôle physiologique dans la sécrétion de métabolites et de xénobiotiques naturels. Des
Pgps fonctionnelles ont été retrouvées chez des cellules souches et leucocytaires humaines.
L’expression des Pgps chez les leucocytes peut jouer un rôle important dans le traitement de
certaines maladies telles que le VIH, ou les maladies auto-immunes. Des études s’intéressants à
ces phénomènes ont permis de montrés l’implication des Pgps dans la modulation de
l’inflammation par le relargage de cytokines. En effet, plusieurs petites molécules
pro-inflammatoires ont été décrites comme étant des substrats des transporteurs ABC des cellules des
mammifères. Une étude récente a montré, le rôle des Pgps dans le transport du PAF «
platelet-activating factor » et de la leucotriène qui sont des molécules impliquées dans la réaction
inflammatoires [100]. Ces dernières années plusieurs études ont montré l’implication des Pgps
dans l’efflux de cytokines telles que le TNF-α, ILs (IL-2, IL-4, IL-12) [101, 102] et l’IFN-γ [103,
104]. D’autres ont montré la diminution de la sécrétion des cytokines par l’inhibition des Pgps
[17, 18]. L’inhibition de l’activité des Pgps des cellules NK est corrélée à une diminution de la
cytotoxicité de ces cellules suggérant une implication des Pgps dans la sécrétion des composés
cytotoxiques des cellules immunitaires [19].
Objectifs de la Thèse
Si les P-glycoprotéines des nématodes parasites sont largement étudiées pour leur
implication dans la résistance aux xénobiotiques, leur rôle potentiel dans l’interaction hôte /
parasite reste largement méconnu.
Le premier objectif de ce travail était d’étudier le potentiel rôle des Pgps dans
l’échappement aux produits de dégranulation des éosinophiles. En effet, les granulocytes et en
particulier les éosinophiles sont des cellules effectrices majeures rencontrées lors d’une
infestation par un nématode. Des études ont montré la capacité des éosinophiles à interagir in
vitro [105] et in vivo [106] avec les larves infestantes d’H. contortus. Dans ce contexte, nous
avons envisagé l’implication des Pgps du nématode parasite H. contortus dans la détoxication des
produits cytotoxiques de l’hôte. Afin de vérifier notre hypothèse, la première étape de ce travail a
consisté à analyser la modulation du transport de la Rhodamine 123 par les produits des granules
contenus dans les éosinophiles. Dans un second temps, nous avons analysé la cinétique
d’expression des Pgps d’H. contortus au cours du développement du nématode dans le but
d’identifier les Pgps qui pourraient être surexprimées et potentiellement impliquées dans la
détoxication des produits toxiques de l’hôte in vivo. Dans un troisième temps, nous avons mesuré
la modulation de l’expression des ARNm des Pgps sélectionnées par les produits des granules des
éosinophiles in vitro.
Le second objectif était d’étudier la survie des nématodes parasites chez leurs hôtes. Les
nématodes sont auxotrophe au cholestérol, pourtant cette molécule est indispensable à leur survie.
Chez le nématode modèle libre C. elegans la Pgp-2 est impliquée dans l’acidification des
lysosomes intestinaux et le stockage des lipides. Nous avons donc émis l’hypothèse que comme
chez le nématode modèle, la Pgp-2 des nématodes parasites peut être impliquée dans le transport
du cholestérol. Le nématode murin H. polygyrus bakeri a été utilisé pour répondre à cette
deuxième question. Ce nématode est utilisé depuis des nombreuses années en tant que model
pour étudier les interactions nématode parasite / hôte. Nous avons d’abord procédé à
l’identification de la Pgp-2 d’H. polygyrus bakeri et analysé sa cinétique d’expression durant le
développement du parasite. La seconde étape du travail a consisté à mesurer la modulation de
l’expression d’Hba-pgp-2 par le cholestérol. Enfin pour mieux caractériser cette protéine, sa
production en système hétérologue (Pichia pastoris), ainsi que la complémentation d’isolat du
nématode modèle libre C. elegans KO pour la Pgp-2 par Hba-pgp-2 ont été initiées.
