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Étude du rôle des P-glycoprotéines dans le dialogue moléculaire entre Haemonchus contortus et
Heligmosomoides polygyrus bakeri et leurs hôtes
Mohamed Issouf
To cite this version:
Mohamed Issouf. Étude du rôle des P-glycoprotéines dans le dialogue moléculaire entre Haemonchus contortus et Heligmosomoides polygyrus bakeri et leurs hôtes. Microbiologie et Parasitologie. Univer- sité François Rabelais (Tours), 2013. Français. �tel-02808712�
UNIVERSITÉ FRANÇOIS – RABELAIS DE TOURS
ÉCOLE DOCTORALE SSBCV
Équipe multirésistance et pouvoir pathogène des nématodes
THÈSE présentée par :
Mohamed ISSOUF
soutenue le : 16 décembre 2013
pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François – Rabelais de Tours
Discipline/ Spécialité : Science de la vie et de la santé
Etude du rôle des P-glycoprotéines dans le dialogue moléculaire entre Haemonchus
contortus et Heligmosomoides polygyrus bakeri et leurs hôtes
THÈSE dirigée par :
M NEVEU Cédric Chargé de recherche, HDR INRA Val de Loire - Tours Co-encadré par :
Mme BLANCHARD-LETORT Alexandra Chargé de recherche INRA Val de Loire – Tours RAPPORTEURS :
Mme LESPINE Anne Directeur de recherche, INRA d Toulouse
M JACQUIET Philippe Professeur, Ecole nationale vétérinaire - Toulouse
JURY :
M BEECH Robin Professeur, université McGill - Montréal M DI PIETRO Attilio Directeur de recherche CNRS - Lyon
M GOUDEAU Alain Professeur, université François Rabelais - Tours M JACQUIET Philippe Professeur, école nationale vétérinaire - Toulouse Mme LESPINE Anne Directeur de recherche, INRA - Toulouse
M NEVEU Cédric Chargé de recherche INRA Val de Loire - Tours Mme RICHARD Simone Maître de conférences, université de Toulon
Remerciements
« Un seul doigt ne peut attraper les puces » ce proverbe créole définit bien ma vison de la recherche après ces années passer auprès d’une équipe de recherche qui a su me faire une petite place et me soutenir tout au long de ce travail.
Je tiens à remercier mon directeur de thèse Cédric Neveu de m’avoir confié ce projet et accueilli dans son équipe. Je lui suis également reconnaissant pour le temps conséquent qu’il m’a accordé, ses qualités pédagogiques et scientifiques et sa sympathie. J’ai beaucoup appris à ses côtés et je lui adresse ma gratitude pour tout cela.
Je tiens aussi à remercier ma directrice de thèse Dominique Kerboeuf pour son attention de tout instant sur mes travaux de thèse et pour ses multiples conseils et pour toutes les heures qu'elle a consacrées à diriger cette recherche.
Je tiens également à remercier Jacques Cabaret pour son accueil, sa bonne humeur et tous les excellents conseilles qu’il m’a donné.
Je souhaite remercier le Pr Phillipe jacquiet de l’école vétérinaire de Toulouse, le Dr Anne Lespine de l’INRA de Toulouse, le Pr Robin Beech de l’université de McGill à Montréal, le Dr Attilio Di Pietro du CNRS de Lyon, le Dr Simone Richard de l’université de Toulon ainsi que le Pr Alain Goudeau de l’université François Rabelais de Tours d’avoir accepté de participer a mon jury de thèse.
« Les diamants ont leurs prix mais un bon conseil n’en a pas », j’ai eu la chance durant ma thèse de travailler avec des collègues qui m’ont beaucoup appris. Je souhaite tout particulièrement remercier Fabrice Guégnard et Christine Sauvé pour les conseils et l’aides qu’ils m’ont apporté durant ce travail, je remercie également Jacques Cortet et Christine Koch. « La véritable amitié ne gèle pas en hiver. » Au Dr Claude Charvet, tu es pour moi plus qu’un collègue, un ami car tu as toujours étais la pour me soutenir et m’aider dans les moments difficiles, et tes conseils scientifiques et techniques m’ont été indispensable pour avancer tout au long de ma thèse. Pour tout cela je te remercie.
Je souhaite également remercie le Dr Alexandra Blanchard-Letort pour ces conseils et la
correction de ce manuscrit. Je remercie la PFIE, ainsi que les autres membres de l’unité ISP à
commencer par la directrice Dominique Buzoni-Gatel, Yves Le Vern de la plateforme de
cytométrie en flux, Anne - Christine Lalmanach, Françoise Drouet et Fabrice Laurent pour leurs aides et conseils.
Je remercie mes anciens collègues Aymeric alias Kemy et Alexia qui m’ont encadré pendant mes stages de Master, merci à Elise pour l’aide au labo et « les choupetta », merci également à mes anciens stagiaire Anthony, Arthur et Nasrine. Je souhaite aussi remercier Caroline, Abdallah, les collaborateurs de l’université de McGill Thomas, Ainsley, Clémence, Elizabeth, Karine, Lucienne, Vanessa… qui m’ont chaleureusement accueillit dans leur laboratoire.
Je remercie également les compagnons de la table ronde Greg, Karine, Benoit, Gaëlle, Nicolas, Louis, et tous les autres… je remercie aussi mes copains Ayame, Benjamin, Spoune, Sheals, Alex, Duffy, Djane, Djidji, Stam, BNJ et Aboulkassim Abidi alias Maiky pour leurs soutiens.
« Oublier ses ancêtres, c’est être un ruisseau sans source, un arbre sans racines » en rédigeant ces quelque mots, j’ai une pensé tout particulière à ma grand-mère Fatima Issa, une femme formidable qui nous a hélas quitté trop tôt mais qui reste et restera toujours présente. « Le plus difficile n’est pas de faire les enfants mais de les nourrir » ce dicton définit bien le rôle des parents. Je remercie mon père qui a fait beaucoup de sacrifice en cumulant son travail d’instituteur avec la pêche et l’agriculture pour pouvoir nourrir et éduquer ces enfants, je remercie également ma mère qui resta femme au foyer pour s’occuper de l’éducation des ces 11 enfants et qui a toujours su nous motivé.
« On a trois amis sûrs, son père, sa mère et sa femme », A ma femme, Sitti je te remercie pour ces
dizaines d’années que tu as passé près de moi pour m’avoir donné ta confiance et ton soutient de
tout instant. A mes frères et sœurs Wiri, Afi, Bamka, Hariri, Toumime, El habib, Soiffa,
Nassifati, Ayasse et Layla sans oublié mes cousines, cousins, nièces et neveux.
Résumé
Le parasitisme est un des principaux problèmes dans les élevages des ruminants. Les nématodes parasites du tractus digestif des ovins et caprins sont responsables d’importantes baisses de rendement. La maîtrise de ces parasitoses a été longtemps basée sur l’utilisation de molécules anthelminthiques. Cependant, l’efficacité des traitements est fréquemment remise en cause par l’émergence d’isolats résistants à une ou plusieurs de ces molécules. Dans ce contexte, une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans l’installation et la survie des parasites dans leur hôte est essentielle pour le développement de méthodes de lutte efficaces. Les P-glycoprotéines sont des pompes membranaires de la superfamille des transporteurs ABC. Ces pompes transportent des molécules très variées qui ont en commun leur caractère hydrophobe.
Nous avons émis l’hypothèse de l’implication de ces transporteurs dans l’interaction hôte- parasite. Dans le contexte de ce travail nous avons identifié des séquences partielles ou complètes d’ADNc de 9 Pgps du nématode parasite Haemonchus contortus. Une forte activation des Pgps des nématodes en présence des produits de dégranulation des éosinophiles de l’hôte a été observée, démontrant ainsi l’interaction entre les Pgps des nématodes et les produits issus de l’hôte. De plus, l’exposition in vitro des nématodes parasites aux produits de l’hôte montrent après analyse par PCR quantitative une induction significative de l’expression de deux Pgps (Hco-pgp-3, et Hco-pgp-16). Chez le nématode murin Heligmosomoides polygyrus bakeri 5 Pgps ont été identifiés. D’autre part, l’analyse du niveau d’expression des Pgps d’H. bakeri a permis de montrer que le gène Hba-pgp-2 est exprimé uniquement chez les stades en contact avec les produits de l’hôte (œufs, L4 et adultes). De plus, une induction spécifique d’Hba-pgp-2 par le cholestérol a été observée suggérant ainsi l’implication d’Hba-pgp-2 dans la capture et/ou la distribution des stérols des cellules de l’hôte indispensable aux nématodes. Ce travail constitue la première mise en évidence de l’interaction entre les Pgps des nématodes parasites et des produits issus de leur hôte. Ces résultats constituent une base solide pour le développement d’une méthode efficace permettant de bloquer ces transporteurs et d’éliminer les nématodes parasites.
Mots clés : Nématode, éosinophile, P-glycoprotéine, cholestérol, interaction hôte-parasite
Résumé en anglais
Gastrointestinal nematodes cause significant economic loses in goat and sheep livestocks.
Control of these parasites is mainly based on anthelmintic treatments. However, the efficacy of these molecules is questioned by the emergence of isolates resistant to one or several antiparasitic drugs. In this context, a better understanding of the mechanisms involved in the nematode parasites establishment and survival in the host is essential for the development of an effective control methods. P-glycoproteins are membrane pumps belonging to the ABC transporter family.
These pumps transport a wide range of hydrophobic molecules. In the present study, we hypothesized that in addition to their critical role in xenobiotic resistance, helminth ABC transporters such as P-glycoproteins (Pgps) may also be involved in the transport of host products. Using the sheep parasitic nematode Haemonchus contortus, we investigated the modulation and expression of parasite Pgps activity in response to host eosinophil granule products. These works allowed to identify nine partial or complete H. contortus Pgps. Using a rhodamine efflux assay, we provided functional evidence that host eosinophil granule products can activate Pgps from the parasite suggesting that granule products could act as potential modulators of the ABC transporters activity. We showed by quantitative RT-PCR that among nine different H. contortus Pgp genes; Hco-pgp-3, Hco-pgp-9.2, Hco-pgp-11 and, Hco-pgp-16 were specifically up-regulated in parasitical life stages suggesting a potential involvement of these Pgps during the host-parasite interaction. Using exsheated L3 larvae, we demonstrated that eosinophil granules induced in a dose response manner an overexpression of Hco-pgp-3 and the closely related Hco-pgp-16 gene highlighting the possible involvement of these Pgps in host product transport. The mice parasitic nematode Heligmosomoides polygyrus bakeri was used for studying the involvement of Pgps in the cholesterol transport. These works allowed identifying five Pgps in H. polygyrus bakeri. The analysis of the mRNA expression level of H. polygyrus bakeri Pgps has shown that Hba-pgp-2 gene is expressed only in stages in contact with host products. In addition, a specific induction of Hba-pgp-2 by cholesterol was observed suggesting the involvement of Hba-pgp-2 in the capture and / or distribution of cholesterol from host cells.
Taken together, our results provide the first evidence that a subset of helminth Pgps could be involved in the transport of host products. This opens the way for further studies aiming to explore the function of helminth Pgps in host-parasite interactions including host immune response evasion.
Key words: Nematode, P-glycoprotein, eosinophil, cholesterol, immune evasion
.
Liste des tableaux ... 9
.
Liste des figures ... 10
.
Liste des annexes ... 12
.
Introduction ... 13
.
Contexte bibliographique général ... 15
I. Les Trichostrongles : nématodes parasites du tube digestif ... 16
1. Généralités ... 16
2. Les strongles gastro-intestinaux ... 16
1. Heligmosomoides polygyrus bakeri ... 18
1. Haemonchus contortus ... 18
a) Cycle biologique ... 18
b) Physiopathologie ... 19
II. Moyens de lutte ... 20
1. Les anthelminthiques ... 20
a) Modes d’action ... 20
b) Résistance aux anthelminthiques ... 21
2. La lutte alternative ... 21
a) Gestion des pâturages ... 22
b) Lutte biologique ... 22
c) Sélection d’ovins résistants ... 22
d) Vaccination ... 23
III. Survie des Trichostrongles au cours de la phase parasitaire ... 23
1. Réponse de l’hôte ... 24
2. Adaptation à la réponse de l’hôte ... 26
IV. Les transporteurs ABC ... 26
1. Généralité ... 26
2. Les P-glycoprotéines (Pgps) ... 28
a) Caractéristiques fonctionnelles et structurales des Pgps ... 29
b) Les P-glycoprotéines et la résistance aux xénobiotiques ... 30
c) Interaction entre les pompes et les mécanismes immunitaires de l’hôte ... 32
.
Objectifs de la thèse ... 33
.
Matériels et méthodes ... 35
I. Obtention des granules des éosinophiles ... 36
1. Purification des éosinophiles ... 36
2. Purification des granules ... 36
3. Electrophorèse sur Gel SDS-PAGE ... 37
II. Test d’efflux de la Rodamine 123 ... 37
1. Test de la viabilité des œufs ... 37
2. Test d’efflux... 37
III. Obtention des parasites ... 38
1. Extraction des œufs et récupération des L2 ... 38
2. Récupération des L3 et xL3 ... 39
3. Récupération des L4 et vers adultes... 39
IV. Rétro-transcription et amplification par PCR ... 39
1. Extraction des ARN totaux ... 39
2. Rétro-transcription des ARNm ... 40
3. Amplification par PCR ... 40
V. Clonage de fragments d’ADNc ... 41
1. Insertion des inserts dans les vecteurs plasmidiques... 41
2. La transformation des bactéries et levure ... 42
I. Contexte bibliographique ... 47
II. Résultats ... 48
1. Identification des P-glycoprotéines d’H. contortus exprimées au stade adulte ... 48
2.
Interaction entre les protéines des granules des éosinophiles et des Pgps d’H. contortus ... 50
a) Purification des éosinophiles ... 50
b) Modulation de l’activité des Pgps par les granules des éosinophiles ... 52
c) Analyse de l’expression des Pgp d’H. contortus ... 54
III. Discussion ... 60
IV. Perspectives ... 63
.
Interaction entre le cholestérol et les Pgps ... 64
I. Contexte Bibliographique ... 65
II. Résultats ... 68
1. Identification des P-glycoprotéines ... 68
2.
Analyse de l’expression d’Hba-pgp-2 ... 69
a) Hba-pgp-2 est exprimé aux stades œuf, L4 et adulte au cours du cycle de vie d’H. polygyrus bakeri ... 69
b) Induction de l’expression d’Hba-pgp-2 par le cholestérol ... 70
3. Expression d’Hba-pgp-2 dans un système d’expression hétérologue Pichia pastoris ... 71
III. Discussion ... 75
IV. Perspectives ... 77
.
Conclusion générale ... 78
.
Références bibliographiques ... 79
.
Annexes ... 94
Tableau 1 : Nombre de nématodes décrits et leur mode de vie d’après Hugot et al, 2001. ... 16 Tableau 2 : Fonction et localisation des P-glycoprotéines du nématode modèle C. elegans. ... 31 Tableau 3 : Séquences d’amorces utilisées pour l’identification des P-glycoprotéines. ... 41 Tableau 4 : Séquences d’amorces utilisées pour l’analyse par PCR quantitative chez H. polygyrus bakeri. ... 44
Tableau 5 : Séquences d’amorces utilisées pour l’analyse par PCR quantitative chez H. contortus.
... 45 Tableau 6 : P-glycoprotéines identifiées chez H. contortus avec leur meilleur score de blastx. ... 50 Tableau 7 : P-glycoprotéines identifiées chez H. polygyrus bakeri avec leur meilleur score de blastx. ... 68
. Liste des tableaux
Figure 1: Représentation schématique de la morphologie du trichostrongle Haemonchus contortus mâle (A) et femelle (B) d’après Neveu-Lemaire, 1936. ... 17
Figure 2 : Cycle biologique des strongles gastro-intestinaux. ... 19 Figure 3 : La réponse effectrice de type Th2 dans l’immunité anthelminthique. D’après Anthony et al, 2007. ... 25
Figure 4 : Diversité structurale des ABC transporteurs d’après Sheps et al, 2004 ... 27 Figure 5: Organisation structurale des P-glycoprotéines. Vue de devant (A) et de derrière d’une Pgp. ... 28 Figure 6 : Modèle de transport de substrat par les P-glycoprotéines d’après Aller et al, 2009. .... 29 Figure 7: Alignement de la région 3’ des séquences nucléotidique d’ Hco-pgp-9.1, Hco-pgp-9.2 et Hco-pgp-99.3. ... 49 Figure 8 : Alignement de la région C-terminale des séquences protéiques déduites d’ Hco-pgp- 9.1, Hco-pgp-9.2 et Hco-pgp-9.3. ... 49
Figure 9 : Purification des éosinophiles provenant d’un mouton infesté par H. contortus. ... 51 Figure 10: Vérification de l’intégrité des œufs d’H. contortus après contact avec les produits des granules des éosinophiles. ... 52 Figure 11: Test d’efflux de la rhodamine 123 par les œufs d’H. contortus stimulés par les produits des granules des éosinophiles. ... 53 Figure 12: Expression des ARNm des Pgps au cours du développement d’H. contortus. ... 54 Figure 13: Expression des ARNm des Pgps d’H. contortus chez des larves xL3 après 24h d’incubation avec des doses croissantes de protéines contenues dans les granules des éosinophiles. ... 56
. Liste des figures
Figure 14: Alignement des séquences protéiques d’Hco-pgp-16, Hco-pgp-3, Cel-pgp-3 et Cel- pgp-4. ... 58 Figure 15: Réseau phylogénétique incluant les séquences des Pgps de C. elegans, Hco-pgp-3, Hco-pgp-16 et leurs homologues les plus proches. ... 59
Figure 16: Modification des stérols par les nématodes. D’après Matyash et al, 2001. ... 65 Figure 17: Absorption intestinale du FITC-dextran. (A) C. elegans sauvage et (B) mutant Pgp-2.
D’après Nunes et al, 2003. ... 66 Figure 18: Taux de survie de C. elegans sauvage (Wild type) ou mutant Pgp-2 (gk114) après culture dans des conditions standards ou restrictives en cholestérol... 67 Figure 19: Réseau phylogénétique incluant les séquences des Pgps de C. elegans, Hba-pgp-2, Hco-pgp-2 et leurs homologues les plus proches. ... 69
Figure 20: Analyse de l’expression d’Hba-pgp-2 chez les différents stades de développement. .. 70 Figure 21: Analyse de l’expression des Pgps et de Hba-haf-9 (autre sous-famille de transporteurs ABC) en présence ou non de cholestérol (+ : présence, - : absence) chez les stades larvaire L1/L2.
... 70 Figure 22: Produits d’amplification de l’ADNc de Hba-pgp-2 chez le stade adulte d’H. polygyrus bakeri obtenus par RT-PCR. ... 72
Figure 23: Produits d’amplification avec les amorces AOX1F et AOX1R permettant de vérifier
l’intégration ou non du plasmide dans le génome de Pichia pastoris. ... 72
Figure 24: Vérification de la production d’HBA-PGP-2 par Dot blot en utilisant l’anticorps anti-
HIS qui reconnait le tag HIS rajouté en position C-terminale de la Pgp-2. ... 73
Figure 25: Profil protéique des levures ayant intégré Hba-pgp-2 et Analyse de la purification
d’Hba-pgp-2 à partir d’une culture des levures recombinantes. ... 74
. Liste des annexes
Annexe 1 : article 1 Host eosinophil granules interact with Haemonchus contortus P-
glycoproteins: A novel insight in to the role of ABC transporters in host-parasite interaction ... 95
Annexe 2 : Article 2 Membrane Drug Transport in Helminths ... 105
Annexe 3 : article 3 cDNA-AFLP analysis in levamisole-resistant Haemonchus contortus reveals
alternative splicing in a nicotinic acetylcholine receptor subunit ... 121
Annexe 4 : Résumé communication orale colloque ABC 2011 (Paris) ... 125
Annexe 5 : Résumé communication orale Colloque ABC 2012 (Bruxelles) ... 126
Annexe 6 : Communication affichée présentée à Journée du département Santé Animale 2013
(Agde) ... 127
Les nématodes parasites du tractus gastro-intestinal sont, en raison des pertes économiques qu’ils engendrent, un des principaux problèmes dans les élevages ovins et caprins [1]. Parmi ces parasites, les strongles gastro-intestinaux, provoquent des lésions et des perturbations physiologiques entrainant des baisses de rendement dans la production de lait, de laine, de viande et voire même la mort des animaux les plus affaiblis. [2].
Le contrôle de ces parasites est essentiellement basé sur l’utilisation d’anthelminthiques appartenant à quatre familles chimiques : les benzimidazoles [3], les imidazothiazoles [4], les lactones macrocycliques et plus récemment, les dérivés d’amino-acétonitrile [5]. Cependant, l’efficacité de ces traitements est remis en cause par l’émergence d’isolats résistants à une ou plusieurs de ces molécules [6]. Il est donc nécessaire de pérenniser l’efficacité des molécules existantes et/ ou de développer des nouvelles stratégies de lutte.
A l’heure actuelle, plusieurs méthodes alternatives sont explorées pour optimiser la lutte contre les strongles digestifs [7, 8]. La première stratégie consiste à rationaliser la gestion des pâturages. Le but de cette stratégie consiste à mettre les agneaux dans des pâtures exemptes de larves infestantes. La seconde stratégie est basée sur la sélection d’ovins résistants aux infestations [9, 10]. La recherche d’antigènes vaccinaux contre ces strongles digestifs n’a pour l’heure pas encore permis d’obtenir de résultats probants. Actuellement, ces stratégies alternatives ne peuvent pas se substituer aux traitements anthelminthiques.
Dans ce contexte, une meilleure connaissance des processus impliqués dans l’établissement et la survie des nématodes parasites du tractus gastro-intestinal est nécessaire pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce fait, nous nous sommes intéressés dans le cadre de ce travail de thèse d’une part aux mécanismes de détoxication cellulaires permettant aux parasites d’échapper à la toxicité des produits de la réponse immunitaire de l’hôte, et d’autre part à la capture de certains métabolites nécessaires à leur
. Introduction
impliquées dans le transport de cytokines [17, 18] et de produits cytotoxiques [19] secrétés par les cellules immunitaires. Les molécules transportées sont très variées. Elles ont en commun leur caractère hydrophobe. Quel pourrait être alors le rôle des Pgps chez les nématodes dans les mécanismes de capture des produits toxiques ou nécessaires à leur survie issus des cellules de l’hôte ? Chez les nématodes l’implication des Pgps dans le métabolisme des stérols et le transport des anthelminthiques est maintenant bien établie [20, 21]. Les nématodes étant auxotrophes à ces molécules la capture de ces derniers est indispensable à leur survie [22].
Dans ce contexte, mon travail de thèse s’est orienté vers la recherche, la caractérisation et l’étude de l’interaction des Pgps avec différents produits issus de leur hôte chez deux espèces de strongles digestifs Haemonchus contortus et Heligmosomoides polygyrus bakeri. L’objectif était d’établir le rôle potentiel des p-glycoprotéines des nématodes dans le transport des produits de l’hôte.
Les trois principaux axes de recherche abordés dans ce travail étaient :
1. L’étude fonctionnelle globale du transport de produits issus des cellules de l’hôte par les P-glycoprotéines des nématodes parasites.
2. L’identification des transcrits des P-glycoprotéines chez nos deux modèles d’étude.
3. L’analyse de la modulation du niveau d’expression des ARNm des Pgps des nématodes
durant le cycle de vie des parasites et après stimulation par les produits de l’hôte.
. Contexte bibliographique général
I. Les Trichostrongles : nématodes parasites du tube digestif
1. Généralités
Les nématodes présentent une grande diversité de modes de vie. Certains sont parasites d’animaux ou de plantes et d’autres sont libres comme le nématode modèle Caenorhabditis elegans [23]. À l’heure actuelle, plus de 26 000 espèces de nématodes ont été décrites, parmi lesquelles 45% sont parasites d’animaux vertébrés et invertébrés (Tableau 1) [23].
Libre Parasites de plantes Parasites d’animaux invertébrés
Parasites d’animaux vertébrés
Totale
Nombre d’espèces
10681 4105 3501 8359 26646
Tableau 1 : Nombre de nématodes décrits et leur mode de vie d’après Hugot et al, 2001.
Parmi les parasites, les nématodes du tube digestif ou « strongles gastro-intestinaux », sont responsables d’importantes pathologies chez les ruminants à l’échelle mondiale.
Dans les élevages, les trichostrongles représentent le groupe de strongles gastro- intestinaux le plus répandu et ayant le plus fort impact agronomique [7].
2. Les strongles gastro-intestinaux
La systématique des trichostrongles repose sur des caractères morphologiques et
moléculaires. L’adulte mâle se distingue de la femelle par la présence d’une bourse caudale et de
spicules à son extrémité postérieure (Figure 1). Ces éléments permettent l’identification des
différentes espèces de strongles [24] par l’étude des critères morphomètriques de ces structures.
Figure 1: Représentation schématique de la morphologie du trichostrongle Haemonchus contortus mâle (A) et femelle (B) d’après Neveu-Lemaire, 1936.
De nos jours, la systématique est basée sur l’analyse des séquences des ARNs ribosomaux (ARNr) [25], ou bien du polymorphisme des iso-enzymes ou de l’ADN génomique [26].
Les trichostrongles gastro-intestinaux des ruminants domestiques appartiennent à la
famille des Trichostrongylidae qui regroupe quatre sous-familles : les Cooperiinae, les
Ostertagiinae, les Trichostrongylinae et les Haemonchinae [27]. La diversité des genres et
espèces est plus importante chez les ovins et caprins que chez les bovins. Haemonchus contortus,
Teladorsagia circumcincta et Trichostrongylus colubriformis sont les trois espèces de strongles
les plus fréquemment rencontrées dans les élevages de petits ruminants. Le nématode murin
Heligmosomoides polygyrus bakeri est communément utilisé comme espèce modèle des
trichostrongles dans les laboratoires de recherches du fait du nombre conséquent d’outils
disponibles chez la souris pour étudier la réponse immunitaire de l’hôte [28].
1. Heligmosomoides polygyrus bakeri
H. polygyrus bakeri est un nématode parasite de l’intestin grêle de la souris. Lors de l’infestation, les larves envahissent la muqueuse du duodénum puis migrent dans la sous- muqueuse à proximité de la couche musculeuse. Les vers quittent la muqueuse et rejoignent les villosités intestinales où ils se développent en adultes mâles et femelles et s’accouplent. Les femelles pondent ensuite leurs œufs pendant quelques semaines à plusieurs mois selon les modèles murin [29]. H. polygyrus bakeri est utilisé en tant qu’organisme modèle notamment pour l’étude de la réponse de l’hôte lors d’une infestation helminthique. Dans ce cadre, H. polygyrus bakeri a été utilisé en parallèle d’H. contortus pour l’étude de la potentielle interaction entre les Pgps des nématodes et des produits issus de leurs hôtes.
1. Haemonchus contortus
H. contortus est l’un des trichostrongles les plus pathogènes du fait de son caractère hématophage. Ce nématode est inféodé à la caillette et provoque chez l’hôte une anémie importante pouvant conduire à la mort de l’animal [30]. De plus cette espèce possède une fécondité très élevée par rapport aux autres trichostrongles des petits ruminants, avec en moyenne 5000 à 7000 œufs excrétés par femelle et par jour contre environ 600 pour Teladorsagia circumcincta et Trichostrongylus colubriformis.
Les zones chaudes et humides sont très favorables au développement de ce parasite.
L’haemonchose ovine est donc très répandue en zone tropicale et subtropicale ou 45% de la mortalité des jeunes agneaux est due à ce parasite [31]. Cependant, la présence de plus en plus fréquente d’H. contortus dans les zones tempérées notamment en France est attribuée à la capacité d’adaptation de ce parasite aux variations climatiques [31, 32].
a) Cycle biologique
Les trichostrongles se développent selon un cycle biologique monoxène comprenant deux
phases bien distinctes : la phase libre et la phase parasitaire (Figure 2).
Figure 2 : Cycle biologique des strongles gastro-intestinaux.
La phase libre commence par l’expulsion des œufs dans l’environnement avec les matières fécales de l’hôte. Ces œufs s’embryonnent et après éclosion libèrent des larves 1 (L1), puis après une première mue se développent en larves 2 (L2). Ces 2 premiers stades se nourrissent de matières organiques ainsi que de micro-organismes présents dans les matières fécales. Les larves L2 muent de manière incomplète et se développent en troisième stade larvaire (L3) qui est infestant pour le mouton. Du fait de cette mue incomplète la larve L3 reste engainée dans l’exuvie de la L2. Cela rend ces larves L3 plus résistantes aux conditions du milieu extérieur. Les larves L3 sont très mobiles. Elles peuvent ainsi se hisser à l’extrémité des brins d’herbe, ce qui favorise leur ingestion par l’hôte sur le pâturage. Le nématode commence alors sa phase parasitaire chez le mouton où il atteint rapidement la muqueuse de la caillette. Les larves L3 se dégainent (larves xL3) puis se développent en stades larvaires 4 (L4). A ce stade, les larves effectuent une dernière mue pour atteindre le stade juvénile (stade 5). A maturité sexuelle, les adultes mâles et femelles s’accouplent et les femelles fécondées libèrent leurs œufs dans la lumière du tube digestif. Ces œufs sont ensuite expulsés avec les matières fécales de l’hôte.
b)
dans le tube digestif se traduit par une érosion de la muqueuse conduisant à une infiltration des cellules immunitaires de la muqueuse au niveau des zones endommagées [33]. Tous ces dérèglements aboutissent à une perte de poids [34].
II. Moyens de lutte
En absence de stratégie vaccinale efficace, l’utilisation des anthelminthiques reste le moyen de lutte le plus fréquent dans les élevages.
1. Les anthelminthiques
Les benzimidazoles (BZ), les imidazothiazoles, les lactones macrocycliques et les dérivés d’amino-acétonitriles sont les principales familles de molécules utilisées pour le contrôle des trichostrongles.
a) Modes d’action
Les BZ empêchent l’association des deux sous-unités de la tubuline provoquant la dépolymérisation des microtubules [35, 36].
Les imidazothiazoles sont des agonistes de récepteurs à l’acétylcholine (nAChR) des nématodes [37-39]. Ces récepteurs sont activés par le lévamisole ce qui conduit à une dépolarisation prolongée des cellules musculaires entrainant une paralysie des nématodes qui sont ensuite éliminés par le transit intestinal.
Les lactones macrocycliques ciblent plusieurs récepteurs présents chez les parasites comprenant le récepteur à l’acide γ-amino butyrique (GABA) [40], et les canaux chlorure glutamate-dépendants (GluCl-R) [41]. L’effet des lactones macrocycliques sur ces récepteurs entraine la paralysie du pharynx et des muscles [42].
Le 1
erdérivé d’amino-acétonitrile (AAD) (le monepantel) a été commercialisé en 2008.
Comme les imidazothiazoles, le monepantel cible les AChR. Cette molécule est efficace vis-à-vis
des L4 et des adultes de nombreux nématodes parasites. Cependant, très récemment des isolats de
trichostrongles (Teladorsagia circumcincta et Trichostrongylus colubriformis) résistants à cette
molécule ont été décrits en Nouvelle Zélande [43].
b) Résistance aux anthelminthiques
L’utilisation répétée des molécules anthelminthiques est très répandue dans les élevages créant ainsi une forte pression de sélection sur les populations de parasites. Ceci a abouti à l’émergence d’isolats résistants à un ou plusieurs anthelminthiques. La résistance croisée à plusieurs familles de molécules est une réelle menace pour la viabilité économique de nombreux élevages.
La résistance aux BZ est essentiellement due à la modification de la cible de ces molécules. Ces mutations entraineraient une perte d’affinité de la molécule pour la protéine cible.
Les principales mutations qui ont été identifiées sur des isotypes du gène de la β-tubuline en position F167Y [44], E198A [45] et F200Y [46].
Le mécanisme de résistance aux imidazothiazoles est encore mal connu. Cependant des formes tronquées de certaines sous-unités du récepteur au lévamisole (L-AChR) ont été détectées chez des isolats d’H. contortus résistant au lévamisole [47]. Le rôle d’une de ces formes tronquées dans l’altération de la fonctionnalité du LAChR d’H. contortus a pu être mis en évidence dans un système d’expression hétérologue [39].
Les mécanismes de résistances aux Lactones Macrocycliques (LMs) sont encore mal connus. Des mutations ont été détectées sur les récepteurs cibles des lactones macrocycliques chez des isolats résistants à ces molécules [48]. Cependant, aucun test de validation fonctionnelle n’a été réalisé. La découverte d’isolats résistants à plusieurs molécules anthelminthiques suggère une implication des systèmes non spécifiques de détoxication des xénobiotiques. Le transport des BZs, des LMs et des imidazothiazoles par les Pgps a été rapporté chez les cellules de mammifères [49-51]. Chez les nématodes parasites, des études ont montré l’augmentation de la sensibilité aux BZ en présence du vérapamil (inhibiteur de Pgp) [52]. Ces effets ont été confirmés par l’utilisation d’autres inhibiteurs et d’autres isolats de nématodes parasites (H. contortus et T.
circumcincta) [53].
2. La lutte alternative
de méthodes de lutte autres que chimiques. Plusieurs méthodes de lutte alternatives sont proposées.
a) Gestion des pâturages
La gestion des pâturages associe trois stratégies : prévention, évasion, dilution [7, 8]. La stratégie préventive consiste à mettre, après sevrage, les agneaux dans des pâtures exemptes de larves de nématodes parasites. Le principe de la stratégie d’évasion est de changer de parcelle avant que la contamination de l’herbe ne soit trop importante. La stratégie de dilution, quant à elle, est basée sur l’alternance d’hôtes de sensibilité différente (bovin/ovin par exemple).
Toutefois cette méthode alternative n’est pas suffisante pour assurer à elle seule le contrôle de l’infestation. La gestion des pâturages est donc actuellement souvent complétée par l’emploi d’anthelminthiques.
b) Lutte biologique
De manière plus anecdotique, l’emploi des champignons nématophages est une autre des méthodes proposées pour le contrôle des nématodes parasites. Ce moyen de lutte consiste à répandre des champignons (Duddingtonia flagrans, Arthrobotrys oligospora) prédateurs des stades libres des nématodes gastro-intestinaux dans les pâtures [54]. L’efficacité de cette méthode est étroitement liée aux exigences écologiques des champignons. Le succès ou l’échec de cette méthode est donc difficilement prévisible.
c) Sélection d’ovins résistants
Une autre méthode de lutte alternative repose sur la sélection d’ovins résistants [9]. En
effet, des variations génétiques sur la sensibilité aux parasites ont été constatées entre différentes
races ovines. Par exemple, les races (Barbados Blackbelly, St. Croix) issues des zones tropicales
et humides sont beaucoup moins sensibles aux infestations par les strongles que celles provenant
des zones tempérées [55]. La comparaison entre une race résistante et sensible à l’infestation par
H. contortus a montré une forte augmentation du nombre d’éosinophiles chez la race résistante
(Blackbelly) en comparaison avec la race sensible (INRA 401) [56]. Ce qui suggère l’importance
de ces cellules dans la résistance à l’infestation par les trichostrongles. Cependant, la capacité de
certains isolats d’H. contortus à contourner la résistance remet en cause l’efficacité de cette
approche.
d) Vaccination
Une des méthodes en cours de développement est l’utilisation de vaccin anti-strongles.
Pour être économiquement viables, les futurs vaccins anti-strongles devront être capables de contrôler simultanément les trois principales espèces de strongles [57]. Actuellement, il existe deux classes de vaccins expérimentaux contre les nématodes gastro-intestinaux, les antigènes difficilement accessibles aux effecteurs du système immunitaire dits « cachés » et les antigènes exposées au systèmes immunitaires dits « naturels » [58].
Les antigènes « cachés » proviennent de l’intestin des nématodes parasites et ne sont donc pas directement exposés au système immunitaire. Ces antigènes génèrent une certaine protection contre les nématodes hématophages tel qu’H. contortus du fait de l’ingestion d’anticorps lors du repas sanguin. Malheureusement, ces antigènes ne confèrent pas de protection contre les nématodes qui ne se nourrissent pas de sang tel que T. colubriformis [59].
La deuxième classe d’antigène est issue des produits d’excrétion/sécrétion ou de la surface des parasites. Ils ont donc l’avantage d’être exposés au système immunitaire. Des antigènes issus des produits d’excrétion/sécrétion nommés ES15 et ES24 ont été identifiés chez le nématode H. contortus [60]. L’immunisation des agneaux avec ces antigènes a montré une réduction de l’excrétion fécale d’œuf de 32 à 77%, ainsi qu’une diminution de 64 à 85% de la charge parasitaire. Cependant, l’immunisation des agneaux avec ces protéines recombinantes ne confère donc qu’une protection partielle [61] et par conséquent pas une diminution peu significative des effets néfastes de ces parasites sur la physiologie des animaux.
Dans ce contexte, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’établissement du parasitisme constituerait une avancée déterminante pour identifier de nouvelles cibles vaccinales. L’étude du pouvoir pathogène des strongles digestifs constitue de ce fait l’un des principaux axes de recherche de notre équipe.
III. Survie des Trichostrongles au cours de la phase
évolutive des parasites de la caillette telle que Teladorsagia circumcincta pour leur permettre de coloniser cet environnement hostile. L’augmentation du pH a un effet sur la ponte des œufs d’H.
contortus, le pH optimal étant compris entre 4 et 4,5 [63]. La réduction de l’activité gastrique, provoquée par l’augmentation du pH, permet au nématode parasite de mieux résister à l’activité protéolytique du mucus.
Chez H. contortus, plusieurs produits d’excrétion / sécrétion (ES) ont été étudiés. Ainsi la calréticuline, présente dans les produits ES, empêche la lyse des érythrocytes et fixe des pro- coagulants et le Ca
2+, ce qui facilite le repas sanguin du nématode [64, 65]. Cette molécule a aussi la capacité de séquestrer des molécules du complément pour éviter la destruction des nématodes.
1. Réponse de l’hôte
L’implantation du parasite va aboutir à une accumulation d’éosinophiles et de neutrophiles dans les tissus parasités [66]. Ces deux types cellulaires sont capables de produire des molécules pro-inflammatoires, des dérivés oxygénés toxiques pour les nématodes. Ces cellules produisent aussi des cytokines qui contribuent à la mise en place et à l’orientation de la réponse immunitaire de l’hôte.
La réponse immunitaire induite par les nématodes parasites est une réponse de type Th2.
Les éosinophiles, basophiles, mastocytes et les lymphocytes NK sont essentiels à la fois pour les phases d’initiation et les phases effectrices de la réponse immunitaire Th2. Cette réponse est caractérisée par l’augmentation du taux de l’interleukine 4 (IL-4) et d’autres cytokines de type 2 (IL-5, IL-9, IL-13 et IL-21) qui est corrélée à une multiplication des lymphocytes T-helper 2 (Th2), des cellules plasmatiques sécrétant l’immunoglobuline E (IgE), des éosinophiles, des basophiles et des mastocytes [67, 68].
Les voies de la réponse immunitaire médiées par les lymphocytes T helper 2 sont plus
clairement définies dans l’intestin que dans les tissus, cependant dans les deux cas plusieurs
mécanismes peuvent intervenir (Figure 3).
Figure 3 : La réponse effectrice de type Th2 dans l’immunité anthelminthique.
D’après Anthony et al, 2007.
Dans l’immunité anthelminthe de la muqueuse, la réponse de type Th2 est initiée et
maintenue par des populations de cellules innées (y compris les cellules épithéliales) à travers la
production de l’interleukine 25 (IL-25) et IL-33 [69]. Les cellules épithéliales sont ciblées par des
cytokines de type Th2 telle que l’IL-13 qui augmente le renouvellement des cellules et la
différenciation des mucocytes produisant la mucine et des protéines [70, 71]. Les anticorps
produits par des lymphocytes B contribuent à diminuer la fitness et la fécondité des vers. Dans les
tissus, les parasites subissent l’agression de plusieurs cellules effectrices de l’immunité innée
2. Adaptation à la réponse de l’hôte
L’adaptation des parasites aux mécanismes de défense de leur hôte est indispensable pour leur maintien dans l’hôte. L’installation des strongles gastro-intestinaux chez leur hôte est donc dépendante de leur capacité à moduler la réponse immunitaire de leur hôte. Cette faculté est souvent attribuée aux produits d’excrétion / sécrétion (ES) des parasites. Ces produits peuvent agir à plusieurs niveaux sur le système immunitaire, en perturbant la présentation d’antigène, ou encore en modifiant l’orientation de la réponse des lymphocytes T [73].
Certaines des molécules sécrétées par les nématodes miment des protéines de l’hôte. Ces molécules telles que l’homologue de l’interféron gamma de Trichuris muris permettent aux nématodes parasites de détourner la réponse immunitaire en leur faveur [74]. Chez T.
circumcincta les produits ES des nématodes adultes et des stades L4 contiennent des thioredoxines peroxydases qui peuvent perturber la balance cytokinique th1 / th2 [75, 76]. Les nématodes gastro-intestinaux peuvent aussi produire des inhibiteurs de protéases à cystéines (cystatines) capables de perturber la présentation antigénique. Ces cystatines ont été identifiées chez Nippostrongylus brasiliensis et H. contortus [77]. Les strongles digestifs produisent aussi des molécules altérant le recrutement des cellules effectrices. N. americanus produit des métalloprotéases qui clivent spécifiquement l’éotaxine perturbant ainsi le recrutement des polynucléaires éosinophiles [78]. Cependant, de nombreux éosinophiles sont retrouvés sur le site de l’infestation où ils peuvent déverser leurs produits toxiques.
Dans ce travail, nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires utilisés par les nématodes parasites pour survivre dans leur hôte malgré la présence de ces produits toxiques et plus précisément sur le potentiel rôle des systèmes de détoxication des nématodes impliquant les P-glycoprotéines.
IV. Les transporteurs ABC
1. Généralité
Les P-glycoprotéines appartiennent à la famille des transporteurs ABC (ATP-Binding
cassette). Cette famille de protéines est une des plus étudiées [79]. Ces protéines ont été décrites
chez de nombreux organismes incluant des bactéries [80, 81], des levures [82], des parasites protozoaires [83, 84] ainsi que des nématodes [85] et l’homme [86]. L’appartenance à cette famille se définie par la présence d’un motif de liaison à l’ATP qui est fortement conservé. Un complexe d'au moins deux domaines de liaison de l'ATP (NBD pour « Nucleotide Binding Domain »), couplé à deux blocs de segments transmembranaires (TMD pour « TransMembrane Domain ») semble être le minimum requis pour l’obtention d’un transporteur fonctionnel. Le domaine TMD est très hydrophobe et généralement composé de 6 segments transmembranaires.
Le domaine NBD contient plusieurs séquences consensus, les motifs Walker A et B qui sont des
courtes séquences d’acides aminées fortement conservées chez plusieurs protéines fixant l’ATP
et en particuliers les transporteurs de la famille ABC. La présence de la séquence « LSGGQ »
entre le Walker A et B constitue la signature des transporteurs ABC. Cette famille est divisée en
7 sous-familles, ABCA à ABCG [87] selon leurs séquences en acides aminés et l’organisation de
leurs domaines (Figure 4).
2. Les P-glycoprotéines (Pgps)
Les Pgps sont phosphoglycoprotéines localisées dans la membrane cytoplasmique et constituées d’une seule chaine polypeptidique d’environ 1300 acides aminés. La masse moléculaire de la protéine mature varie entre 130 kDa et 180 kDa. Cette différence est essentiellement liée à la glycosylation. Ces pompes sont composées de deux TMD de 6 segments transmembranaires chacune et de 2 domaines NBD (Figure 5).
Figure 5: Organisation structurale des P-glycoprotéines. Vue de devant (A) et de derrière d’une Pgp.
Les segments transmembranaires (TM1 à 12 sont représentés. La moitié N-terminale
et C-terminale sont colorés en jaune et bleu respectivement. La barre représente la
a) Caractéristiques fonctionnelles et structurales des Pgps
Une des principales caractéristiques des Pgps est leur capacité à transporter des substrats très variés grâce à l’énergie fournie par hydrolyse de l’ATP (Figure 6).
Figure 6 : Modèle de transport de substrat par les P-glycoprotéines d’après Aller et al, 2009.
Fixation du substrat (rose) et de deux molécules d’ATP (jaune) (A). Hydrolyse des deux molécules d’ATP et efflux du substrat (B).
Les substrats transportés par les Pgps incluent des médicaments anticancéreux [88], des hormones stéroïdiennes, des lipides, des antiviraux, des peptides, des pesticides et des molécules anthelminthiques.
Différentes approches expérimentales ont été développées pour étudier la nature des
segment transmembranaire (TM) 4 et 6 et la seconde dans le TMD2 de la partie C-terminale entre le TM11 et le TM12 [89, 90]. La mise en évidence de la sélectivité des sites de fixation des substrats a été réalisée par Shapiro et Ling [91] grâce à l’identification de la coopérativité entre la rhodamine 123 (R123, site R) et le Hoechst 33342 (H33342, site H). Les substrats des Pgps peuvent être classés en trois groupes basés sur leurs interactions avec la R123 et le H33342. Les molécules de classe 1 stimulent le transport de la R123 et inhibent le transport du H33342 (colchicines, quercétine par exemple), les molécules de classe 2 stimulent le transport du H33342 et inhibent celui de la R123 (anthracyclines par exemple) et enfin les molécules de classe 3 inhibent le transport du H33342 et de la R123 (vinblastine, actinomycine D par exemple) [91].
Plus récemment, d’autres études ont montré que certaines molécules telles que la prazosine et la progestérone peuvent stimuler simultanément le transport de la R123 et du H33342, suggérant l’existence d’un troisième site de fixation [92].
b) Les P-glycoprotéines et la résistance aux xénobiotiques
L’importance de ces transporteurs membranaires comme modulateurs de l’effet cytotoxique des xénobiotiques a été suggéré par le phénomène de résistance multiple aux drogues anti-cancéreuses [93]. Les Pgps qui sont surexprimées à la surface des cellules cancéreuses, empêchent l’accumulation des médicaments à l’intérieur des tumeurs et transportent vers le milieu extérieur les médicaments, aboutissant à la résistance des cellules cancéreuses aux drogues. Ce mécanisme de résistance est impliqué dans d’autres échecs thérapeutiques tels que les traitements anti-VIH par des inhibiteurs de protéases [94]. Les Pgps sont aussi impliquées dans le transport de molécules antimicrobiennes et sont responsables des résistances croisées aux médicaments chez les microorganismes d’importance médicale ou agronomique majeur [95, 96].
Ce mécanisme de détoxication remet en cause l’efficacité de nombreux traitements contre les pathologies infectieuses. La capacité des nématodes parasites à développer des résistances croisées à l’encontre de molécules possédant des cibles pharmacologiques très distinctes, a suggéré l’implication des processus de détoxication non spécifiques faisant appel aux Pgps.
Chez les nématodes, 60 gènes codant des transporteurs ABC ont été identifiés chez C.
elegans. Ces transporteurs ABC ont été classés en 7 sous-familles [85]. Les Pgps sont regroupés
dans la sous-famille des ABCB. Chez C. elegans cette sous-famille est représentée par 15 gènes
dont un pseudo-gène. L’analyse de l’expression des ARNm des Pgps, l’analyse de l’activité des
transporteurs et l’utilisation de modulateurs représentent les principales méthodes utilisées pour
étudier ces pompes et leur implication dans la résistance aux drogues. Chez C. elegans l’étude
réalisée sur des souches mutantes pour les Pgp-1 et Pgp-3 ont montré l’implication de ces transporteurs dans la résistance à des toxines bactériennes et à des médicaments [97].
Gène Fonction Localisation
Pgp-1 Défense contre des toxines bactériennes Intestin et pharynx
Pgp-2 Stockage des lipides et formation de
lysosome intestin
Pgp-3 Défense contre des toxines bactériennes Intestin, cellules sécrétrices
Pgp-5 Résistance aux métaux lourds intestin
