Discussion

Les éosinophiles sont des cellules effectrices ayant un rôle central lors d’une infestation

helminthique. Nous avons émis l’hypothèse selon laquelle les Pgps des helminthes parasites

pourraient être impliquées dans la détoxication des protéines des granules des éosinophiles. Les

granules des éosinophiles sont principalement composés de quatre protéines fortement basiques

et connues pour leur toxicité envers les helminthes. Ces protéines sont constituées de la

peroxydase de l’éosinophile (EPO), la protéine basique majeure (MBP), la protéine cationique de

l’éosinophile (ECP) et la dérivé neurotoxique de l’éosinophile (EDN) [117, 118]. Ces protéines

sont stockées dans des structures cristalloïdes qui peuvent être purifiées par ultracentrifugation

[119]. Cependant, la purification des éosinophiles à partir du sang de mouton reste difficile. Pour

exemple Terefe et al [105] rapporte que l’utilisation d’un gradient avec une seule densité de

Percoll (1,090 g / ml) a permis de purifier des éosinophiles avec une pureté allant de 43 % à 63

%. Dans cette étude, cette approche a été optimisée en utilisant un gradient avec deux densités de

Percoll en combinaison avec de la cytométrie en flux. Cela a permis de purifier une population

cellulaire contenant 95 % d’éosinophiles. Par conséquent, les protéines collectées après la lyse et

l’ultracentrifugation des éosinophiles peuvent être considérées comme des produits des granules

des éosinophiles. La séparation des protéines des granules des éosinophiles purifiés à partir du

sang de mouton sur un gel SDS-PAGE montre un ensemble de protéines de tailles comprise entre

11 et 20 kDa. Certaines d’entre elles pourraient correspondre aux protéines cationiques majeures

(MBP, ECP et EDN) présentant des tailles similaires aux protéines des granules des éosinophiles

humains (13, 16 et 18 respectivement) [120]. Ces protéines cationiques ont été utilisées pour un

test d’efflux de la rhodamine, dans le but d’étudier leur éventuel rôle en tant que modulateurs de

l’activité des Pgps. L’état des œufs d’H. contortus a été analysé après contact avec les protéines

des granules des éosinophiles. L’activation des Pgps du parasite par les protéines des granules des

éosinophiles a été observée en analysant l’efflux de la R123 par les Pgps des œufs d’H. contortus.

Cela a permis de montrer le maintien de l’intégrité de la coque des œufs démontrant ainsi que la

modulation de l’activité de la rhodamine 123 est bien due à un transport et non à une fuite passive

liée à la dégradation de la coque des œufs. Ce résultat a permis de mettre en évidence que les

protéines des granules peuvent contenir des potentiels substrats pour les Pgps des parasites. Il est

intéressant de noter que la relation entre la concentration des protéines des granules et l’efflux de

la rhodamine est similaire à celles observées avec certains substrats classiques des Pgps comme

le Hoest 33342 ou la colchicine [91, 121] suggérant une forte interaction entre les Pgps d’H.

contortus et les protéines des granules. Ce résultat fourni un argument fort pour étudier cette

interaction au niveau moléculaire.

Dans le but d’identifier les Pgps d’H. contortus potentiellement impliquées dans le transport

des protéines de granules in vivo notre premier objectif était d’explorer l’expression des Pgps

dans les stades parasites (L4 et adulte) d’H. contortus. L’analyse bio-informatique précédemment

réalisée sur la base de données génomique d’H. contortus a permis l’identification de 10 gènes

codant potentiellement des Pgps [111]. Parmi ces gènes, 8 séquences partielles ou complètes

d'ADNc ont été identifiées (Hco-pgp-3, Hco-pgp-9a, Hco-pgp-9.2, Hco-pgp-9c, Hco-pgp-10,

Hco-pgp-11, Hco-pgp-14 and Hco-pgp-16) et l’expression d’Hco-pgp-2 déjà décrite a été

confirmée chez le stade adulte mâle.

L’analyse des séquences des Pgps d’H. contortus montre un haut niveau de conservation avec

leurs homologues respectifs chez C. elegans à l’exception d’Hco-pgp-16 chez lequel le plus

proche homologue trouvé dans la base de donnée de Genbank correspond à la Pgp-16 du parasite

de cheval Parascaris equorum. Malgré ce manque d'homologue évident au sein des espèces de

nématodes libres, l'homologue le plus proche chez H. contortus correspond à la séquence

d’Hco-pgp-3. De manière intéressante, trois Pgps homologues de la Pgp-9 de Caenorhabditis elegans ne

différant que par leurs parties 3’ UTR ont été identifiées. L’origine et l’implication fonctionnelle

d’un tel évènement de duplication reste encore à étudier. Enfin, il est important de noter que la

séquence complète du gène Hco-pgp-3 identifiée au cours de ce travail chevauche parfaitement

deux séquences partielles d’ADNc définies comme Hco-pgp-3 et Hco-pgp-4 soulignant la

nécessité d'obtenir la séquence complète de la Pgp avant d'attribuer une nomenclature définitive

aux gènes codant les Pgps d’H. contortus.

Pour les nématodes parasites, la transition vers le parasitisme implique des adaptations

majeures telles que la mise en place de mécanismes d’échappement au système immunitaire de

l’hôte, des changements nutritionnels, métaboliques et de croissance [122, 123]. Par conséquent,

dans le but d’identifier les Pgps potentiellement impliquées dans l’interaction hôte / parasite et

plus spécialement dans la détoxication des produits des granules des éosinophiles, le niveau

d’expression des Pgps d’H. contortus chez les stades libres (œuf et L3) a été comparé à celui des

d’H. contortus pose la question de leur fonction durant l’interaction hôte / parasite. L’homologue

le plus proche d’Hco-pgp-3 correspond à la Pgp-3 de C. elegans qui est impliquée dans la défense

contre des toxines naturelles produites par des plantes et bactéries [97, 126]. L’analyse

phylogénétique a montré que Hco-pgp-16 et ses homologues chez des espèces relativement

éloignées comme Ascaris suum et Parascaris equorum (MRP-3 et PGP-16 respectivement) sont

regroupées dans le même groupe que Cel-pgp-3, cependant leur fonction reste inconnue [124].

Parce qu'il a été rapporté que les substrats des Pgps pouvaient induire la surexpression de leurs

Pgps cibles chez les nématodes [127], la surexpression spécifique d’ Hco-pgp-3, Hco-pgp-9.2,

Hco-pgp-11 et Hco-pgp-16 chez les stades parasitaires peut être considérée comme le reflet de

leur potentielle activation durant l’interaction hôte / parasite. Dès lors, ces quatre gènes candidats

ont été étudiés pour leur potentielle implication dans la détoxication des protéines des granules

des éosinophiles. L’incubation in vitro des larves L3 dégainées (xL3) avec une concentration

croissante de protéines des granules a monté une forte surexpression d’Hco-pgp-3 et Hco-pgp-16

tandis que l’expression d’ Hco-pgp-11 et Hco-pgp-9.2 reste similaire à celles observées chez les

larves xL3 non stimulées. L’induction spécifique de ces deux Pgps relativement proches

(Hco-pgp-3 et Hco-pgp-16) indique qu’une partie des Pgps d’H. contortus pourrait être impliquée dans

la détoxification des produits des cellules immunitaires de l’hôte. Cependant des expériences

supplémentaires seront nécessaires, notamment pour identifiés les substrats des Pgps contenus

dans les granules des éosinophiles.