Les modèles animaux

a. La perfusion intrahippocampique de peptides Aβ (1-40) ou (1-42)

♦ La préagrégation des peptides amyloïdes

Les peptides Aβ sont préparés à la concentration de 0,1 mg.mL^-1 dans du NaCl 0,9% pour la forme Aβ (1-40) et dans de l'eau distillée pour la forme Aβ (1-42). Des aliquots de 100 µL sont stockés à -80°C. Les peptides Aβ sont pré-agrégés par incubation de 3 jours minimum à 37°C avant leur utilisation (Wu et al., 2007).

♦ L'injection des peptides amyloïdes

Figure 47. Photographie d'un rat anesthésié, stéréotaxiquement implanté avec des pipettes en

verres reliées à un pousse-seringue et pouvant perfuser des peptides amyloïdes ou leur milieu de dilution, dans le gyrus denté de l'hippocampe dorsal.

Le rat anesthésié est placé en décubitus ventral sur la table de stéréotaxie (Stoelting, USA). Il est immobilisé et calé grâce à deux barres d'oreilles logées dans le méat auditif et à une barre d'incisives permettant le maintien de la mâchoire. Une incision allant de la région frontale à la région occipitale est réalisée, exposant les sutures coronales, sagittales et transversales. La surface crânienne osseuse est soigneusement ruginée et asséchée, puis les points bregma et lambda sont visualisés. Le trou de trépan, localisé selon les coordonnées stéréotaxiques à partir du bregma, est effectué à l'aide d'une fraise de dentiste, sans endommager le cerveau. Puis les méninges sont délicatement percées à l'aide d'une aiguille. Les coordonnées de localisation des pipettes en verres étirées dans les régions d'intérêt sont déterminées à partir de l'atlas de Paxinos et Watson (1986) (Fig. 47).

Figure 48. Schéma d'implantation des pipettes de perfusion des peptides Aβ dans le gyrus

Les coordonnées d'implantation des pipettes dans le gyrus denté de l'hippocampe dorsal sont: AP est de -3,2 mm, ML sont de ± 1,2 mm et DV est de -3,6 mm (Stéphan et al., 2001) (Fig. 48). Ces pipettes en verres sont reliées à un pousse-seringue (CMA/Microdialysis) qui permet de délivrer les solutions de perfusion à un débit de 1 µL.min^-1, assez faible pour limiter les dommages mécaniques portés au tissu cérébral. Le volume de solution injecté est de 10 µL (soit 1 µg de peptides Aβ) sur une période de 10 min. Une pause de 2 min est observée pour permettre au volume perfusé de stagner sur le site précis d'injection visé. Puis les pipettes sont rehaussées dorsalement en 3 étapes d'un millimètre avec observation d'une pause d'une minute entre chaque étape. Le rat est ensuite suturé à l'aide de fils de suture stériles (Ethicon), le champ opératoire est désinfecté (Bétadine dermique 0,1%) puis un anesthésique local (lidocaïne) est appliqué.

b. La perfusion intracérébroventriculaire (i.c.v.) de peptides Aβ (25-35)

Ce modèle d'injection i.c.v. de peptides Aβ (25-35) a été réalisé par le Dr Sandor Arancibia de l'Université de Montpellier 2 (INSERM U710 et EPHE).

♦ La préparation des peptides amyloïdes

Les peptides Aβ (25-35) et les peptides Aβ (25-35)scramble ("scramble" correspond à un ordre mélangé des acides aminés) (Bachem, Germany), sont dissous dans de l'eau distillée stérile (1 mg.mL^-1). La préagrégation consiste en une incubation de 4 jours à 37°C (Maurice et al., 1996).

♦ L'injection des peptides amyloïdes

La préparation du rat anesthésié sur l'appareil stéréotaxique est la même que celle effectuée pour le modèle d'injection de peptides Aβ (1-40).

Les coordonnées d'implantation stéréotaxique dans les ventricules latéraux par rapport au Bregma sont les suivantes: 0,8 mm selon l'axe AP, 1,5 mm selon l'axe ML et 3,8 mm selon l'axe DV (Stepanichev et al., 2006). Le volume des peptides Aβ (25-35) agrégés injectés est de 5 µL par ventricule latéral, à un débit de 1 µL.min^-1. Il en est de même pour les peptides Aβ (25-35)scramble. Les rats sont bétadinés et suturés. Un délai de 30 jours est observé avant les études autoradiographiques au [¹⁸F]MPPF.

c. L'injection d'une neurotoxine sérotoninergique (5,7 DHT)

♦ La préparation de la neurotoxine

La neurotoxine 5,7 dihyroxytryptamine (5,7 DHT) est préparée le jour même de l'injection à la concentration de 12,5 µg.mL^-1 dans du NaCl 0,9% avec 0,02% d'acide ascorbique. Le rat est préalablement traité avec de la désipramine, un inhibiteur sélectif de la recapture de noradrénaline, à la dose de 10 mg.kg^-1 intrapéritonéalement, 30 minutes minimum avant la lésion. Ce prétraitement permet de protéger les fibres noradrénergiques de la neurotoxine.

♦ L'injection de la neurotoxine

La préparation du rat anesthésié sur l'appareil stéréotaxique est la même que celle effectuée pour le modèle d'injection de peptides Aβ (1-40).

CB

FF

CB

FF

Figure 49. Schéma représentant les pipettes d'injection de la neurotoxine implantées dans les

faisceaux d'innervation sérotoninergique de l'hippocampe dorsal du rat. CB: cingulum bundle; FF: fimbria fornix; IFN: interfascicular nucleus; MRN: median raphe nucleus; DRN: dorsal raphe nucleus; MFB: medial forebrain bundle (d'après Zhou et Azmitia, 1983).

les coordonnées ML sont de ± 1,3 mm et celle DV de -2,4 mm pour le faisceau cingulaire (CB pour "cingulate bundle") et -4,5 mm pour le fimbria fornix (FF) (Fig. 49). Les pipettes en verre sont reliées à un pousse-seringue délivrant la neurotoxine à un débit de 0,1 µL.min^-1 sur une durée de 4 min soit 0,4 µL (5 µg de neurotoxine) par structure visée. Une pause de 2 minutes est observée après l'injection sur chacun des sites, puis 1 minute par millimètre lors de la rétraction des pipettes. Le rat est ensuite suturé puis traité avec un antiseptique local et un anesthésique local (comme décrit précédemment).

d. Le traitement à la pCPA, inhibiteur de la synthèse de sérotonine

La pCPA ou 4-chloro-DL-phénylalanine éthylester hydrochloride (Sigma-Aldrich, France) est un inhibiteur de la tryptophane hydroxylase, enzyme qui intervient dans la synthèse de la sérotonine. Le traitement consiste à injecter quotidiennement 300 mg.kg^-1 (i.p.) de pCPA sur une durée de 5 jours (Compan et al., 1998). Le rat est euthanasié au dernier jour du traitement, 2 heures au minimum après la dernière injection.