Les marqueurs génétiques de l’étude

Séquences ITS

Le terme ITS est l’abréviation pour « internal transcribed spacer », correspondant à une région génétique « non codante », comprise entre les ADN codant pour les sous-unités des ARN ribosomaux 16S et 23S. Cette zone génétique constituée de l’ADNr 16S, d’un ITS contenant l’ADN codant pour deux ARNt, et l’ADNr 23S présente une structure particulière faite d'une succession de domaines dont les vitesses d'évolution sont très variables, s’étalant de relativement élevée à presque nulle. Chacun de ces domaines a son importance pour l'identification moléculaire des micro-organismes. Certaines parties de cette zone génétique sont identiques chez toutes les bactéries et donc utilisables comme sites de complémentarité pour des amorces universelles de séquences ou d'amplification. La comparaison des domaines conservés permet de retracer les liens de parenté qui unissent des bactéries éloignées, tandis que les domaines à vitesse d'évolution plus rapide permettent l'étude des relations phylogénétiques d'espèces plus proches. Les séquences codantes des ARN 16S et 23S sont couramment utilisées pour assigner une espèce à un genre, ou déterminer une espèce au sein d'un genre. Ainsi, les séquences d’ADNr 16S ont largement contribué à la compréhension des relations entre les bactéries (Willems et al. 2003). Cependant, certaines espèces distinctes ont parfois les mêmes séquences 16S ou 23S, et au sein d'un même génome, les différentes copies de ces sous-unités ribosomiques peuvent présenter des séquences différentes. Au sein d’un genre, les séquences d’ADNr 16S sont généralement fortement conservées limitant ainsi les information taxonomique pouvant être déduites de leur comparaison (Willems et al. 2003).

Les séquences ITS sont plus polymorphes et présentent des variations importantes tant au niveau de leur longueur que de leur séquence, même chez des espèces proches (Gürtler & Stanisich 1996). C’est cette particularité qui permet d’entreprendre l’alignement des similarités des séquences d’espèces génétiquement proches, appartenant généralement au même genre. Les séquences ITS sont

maintenant fréquemment utilisées pour des études de diversité au sein d'une espèce, le plus souvent combiné avec d’autres méthodes de génotypage.

Microsatellites nucléaires

Les séquences microsatellites ou SSR (Simple Sequence Repeats) sont des marqueurs génétiques couramment utilisés dans de nombreux domaines de la biologie, que ce soit en biologie des populations, en écologie des populations, en biologie de la conservation, en épidémiologie ou en encore en médecine légale.

Les principales caractéristiques des microsatellites nucléaires par rapport aux allozymes et aux RAPDs, deux autres marqueurs couramment utilisés en biologie des populations, sont présentés dans le Tableau 19 (extrait de Jarne et Lagoda, 1996).

Les séquences microsatellites sont des séquences d’ADN constituées de répétitions en tandem de motifs mono, di, tri ou tétranucléotiques (Figure 20), mais dont la taille totale est inférieure à 100 paires de bases. Ces séquences sont abondantes et largement distribuées dans les génomes eucaryotes. On estime, chez les végétaux, le taux de séquences microsatellites à une tous les 64,6 kb pour les monocotylédones, et une tous les 21,2 kb chez les dicotylédones. Leur succès croissant en tant que marqueurs moléculaires s’explique aussi par leur caractère codominant, leur nature multiallélique, ainsi que par leur grande reproductibilité expérimentale (Varshney et al. 2005). En génétique, ils sont particulièrement attractifs par leur polymorphisme élevé, dû à un taux de mutation pouvant être très important en fonction de l’espèce étudiée, de leurs motifs et de leurs localisations (environ 10-2 à 10-5). Ce fort taux de mutation proviendrait de « dérapages » de la polymérase sur ces répétitions de nucléotides lors de la réplication des chromosomes engendrant des insertions ou des délétions. Leur faible présence au sein de séquences codantes s’expliquerait par une contre sélection en réponse à leur instabilité (Jarne & Lagoda 1996). Mais si ce fort taux de mutation caractérisant les microsatellites est à l’origine de leur intérêt, il est aussi la cause de certains inconvénients. C’est le cas des allèles nuls pouvant provenir d’une modification au sein du site d’hybridation des amorces nucléotidiques utilisées pour l’amplification.

De même le jeu des mutations successives peut amener un même locus microsatellite, à présenter une taille identique chez différents individus sans pour autant provenir du même allèle ancestral. Ce dernier phénomène, nommé homoplasie, tout comme les allèles nuls, peut induire des erreurs d’interprétation concernant la structuration des populations.

Microsatellites chloroplastiques

Tout comme dans le génome nucléaire, des séquences microsatellites sont aussi présentes au niveau de l’ADN chloroplastique des végétaux. Ces microsatellites chloroplastiques sont formés par la répétition d’un motif, le plus souvent poly-A, le polymorphisme de ces séquences concerne donc le nombre de nucléotides « A ». Là aussi, ils se caractérisent par un taux de mutation important, mais somme toute bien plus faible que dans le cas des microsatellites nucléaires. Cette caractéristique permet aux microsatellites chloroplastiques de révéler des histoires évolutives plus anciennes que les microsatellites nucléaires, tout en montrant une importante variabilité intra-spécifique. La transmission uniparentale (généralement maternelle chez les angiospermes et paternel chez les gymnospermes), la nature haploïde et non recombinant du génome chloroplastique, la possibilité d’utiliser des amorces dites « universelles » (Bryan et al. 1999; Weising & Gardner 1999), et l’absence d’hétéroplasmie font des microsatellites chloroplastiques des outils de choix pour étudier l’évolution et la phylogéographie. La contribution des flux de gène par le pollen et les graines à la structuration des populations naturelles, peut être étudié en comparant les marqueurs nucléaires, aux marqueurs chloroplastiques (Provan et al. 2001).

Caractéristiques Allozymes RAPDs

Microsatellites nucléaires

Codominance oui non oui

Neutralité douteuse oui oui

Embryon/juvénil pouvant être

marqué rarement oui oui

Adulte pouvant être marqué oui oui oui

Nombre de loci variables analysés 10-50 10-100 5-20

Nombre d'allèles par locus 1-5 2 1-50

Information moléculaire (structure,

mutation) rarement rarement disponible

Nombre d'individus pouvant être

marqués par unité d'effort 1 1 0,2-0,4

Coût relatif par individu 1 1 3-4

Tableau 19. : Comparatif des principales caractéristiques des microsatellites nucléaires par rapport à deux autres marqueurs couramment utilisés en biologie des populations : les allozymes et les RAPDs (extrait de Jarne et Lagoda, 1996).

Figure 20. : Chromatogramme d’une séquence microsatellite (TA)6(TG)12 visualisée à l’aide du logiciel Chromas 1.45.

Afin d’analyser la diversité, les flux de gènes et la structuration entre les individus et les populations étudiés, nous avons choisi les marqueurs microsatellites nucléaire et chloroplastique. La méthode d’analyse de marqueurs microsatellites est basée ici sur la technique d’amplification de fragments d’ADN (1000 à 4000 paires de bases environ) à l’aide d’amorces nucléotidiques et d’une enzyme, la Taq polymérase (méthode dite de PCR : Polymerase Chain Reaction). Cette méthode permet, après migration des fragments amplifiés sur un gel d’acrylamide soumis à un champ électrique, de déceler des mutations de type insertion ou délétion d’un ou plusieurs nucléotides.

L’étude du génome chloroplastique, de par son faible taux de mutation et de recombinaison (Olmstead & Palmer 1994), permet l’utilisation d’amorces dites « universelles » d’une vingtaine de paires de bases. Ces amorces rendent possible l’amplification spécifique d’une même zone génique chez un grand nombre d’espèces d’Angiospermes. Contrairement au génome chloroplastique, l’étude du génome nucléaire, nécessite de définir des amorces spécifiques à l’espèce étudiée. Chez P. officinalis, huit loci microsatellites nucléaires révélant du polymorphisme ont été isolés et nommés : mPoCIRE01, mPoCIRE04, mPoCIRF08, mPoCIRH02, mPoCIRE09, mPoCIRH08, mPoCIRH07 et mPoCIRF03. La mise au point de ces paires d’amorces est présentée dans la publication I (Muller et al. 2006)