Les approches protéomique exposées précédemment sont complémentaires et ont pour but de permettre la détection et la quantification des peptides/protéines. Les approches de quantification par spectrométrie de masse peuvent être classées en deux catégories : la quantification relative et la quantification absolue. Les méthodes de quantification relative sont principalement utilisées durant la phase de découverte des biomarqueurs alors que les méthodes de ua tifi atio a solue plus p ise so t utilis es da s les phases ult ieu es, est-à-dire pour la validation des biomarqueurs et en clinique. Ces deux approches utilisent soit le marquage isotopique (dilution isotopi ue pou ua tifie les p ot i es soit sa s l utilisatio d isotope la el free). Les différentes approches de quantification qui vont être abordées sont résumées dans la figure 35 ci-dessous :
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a) Quantification relative par spectrométrie de masse
Les méthodes de quantification relative par spectrométrie de masse sont utilisées pour la découverte de biomarqueurs et se font majoritairement par bottom-up. Bien que le top-down soit une approche émergente (II-3). Ces méthodes utilisent essentiellement le data-indépendant a uisitio ui pe et l ide tifi atio et la ua tifi atio des peptides. La ua tifi atio se fait soit sans marquage « label free » ou pa l ajout d u e odifi atio au peptides ajouta t u incrément de masse.
(i) Label free
Les méthodes « label free » utilise t pas de peptides a u s au isotopes sta les i d ajout de
modifications pour la quantification. La quantification relative se fait par la comparaison
d a o da es des p ot i es de deu a i es soit e se asa t su les do es d ide tifi atio
soit su l i te sit des io s.
(a) ‘ sultats d ide tifi atio
Nombre de peptides : Rappsilber et al.217 ont proposé une méthode de comparaison
d a o da e des p ot i es as e su le atio e t e le o e de peptides o se s di is pa
le nombre théorique de peptides tryptiques observables dans une gamme de masse donnée. Le Protein Abundance Index (PAI), cette méthode permet de prendre en compte la taille de la protéine et donc de rendre la comparaison entre différentes protéines possible. Ishihama et al.218 ont proposé une version exponentielle du PAI égale à 10PAI moins un, basé sur
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l o se atio d u e o latio e t e le PAI et le loga ith e de la o e t atio d u e protéine. Plus récemment, Sun et al.219, dans le but de prendre en compte la préparation
d ha tillo , la s pa atio et l a al se pa spe t o t ie de asse : le mSCI (modified spectral counting index) qui est égal au nombre de peptides observé divisé par RIPpro (protein relative identification possibility). Le RIPpro est calculé en considérant le poids moléculaire, le poi t iso le t i ue et l h d opho i it de la p ot i e.
Nombre de spectres : Nombre de spectres MS2 associés à une protéine associant les
i fo atio s edo da tes d ide tifi atio d u peptide o e pa e e ple les différents
tats de ha ge ou u e ou elle d te tio du peptide du fait de la fi de l e lusio dynamique. La corrélation entre le nombre de spectres MS2 et la concentration de protéine, a été premièrement démontré par Liu et al.220 permettant de voir des changements
d a o da es de a i e li ai e su log. Deu outils APEX 221 (absolute protein expression)
et NSAF222(normaliszed spectral abondance factor) permettent la quantification à grande
échelle de protéines en prenant en compte leur taille. Ces méthodes sont limitées par des effets de satu atio à haute o e t atio . C est pou uoi des a ia tes ont été proposées
comme le MS2-TIC223 qui combine le nombre de spectres MS2 avec la moyenne du TIC pour
chaque spectre ou le normalized Spectral Index (SIn)224 qui combine le nombre de peptides
ide tifi s, le o e de spe t es et l i te sit des io s f ag e ts.
(b) Les thodes as es su l e t a tio de l i te sité du signal pour une gamme de m/z : XIC (Extracted ion chromatogram)
Deux étapes de pre-processing sont nécessaires pour les méthodes XIC. En effet, pour minimiser les décalages, les temps de rétentions doivent être alignés entre les analyses afin de fa ilite l ide tifi atio des peptides et l i te sit du sig al doit t e aussi o alis e pou di i ue les iais. Il e iste deu a i es de d te i e l a o da e d u e p ot i e soit e moyennant soit en sommant les XIC des peptides. Pour la moyenne deux possibilités : moyenne de tous les peptides225 ou la moyenne des trois peptides les plus intenses de chaque
protéines226, ces méthodes sont répétables avec des CV < 10%. Pour la somme, généralement
la somme des trois peptides les plus intenses est réalisée227 et une étape de normalisation est
ajoutée en normalisant soit par la taille des protéines soit par la somme des intensités de tous les peptides. Une alternative décrite par Schwanhausser et al.228, est la méthode iBaq
(intensity based absolute quantification) où la somme de tous les peptides est divisée par le nombre de peptides théoriques observables. Cette méthode a été validée avec un mélange de 48 protéines standards montrant un R² de 0,88 pour la protéine UPS2.
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L a a tage des thodes la el-f ee est leu elati e fa ilit à ett e e œu e pa appo t
aux méthodes de dérivation des peptides avec des tags. Le second avantage est que le nombre
d ha tillo s pou a t t e o pa est pas li it o e pou les thodes essita t
u a uage ui o t t e e pos es pa la suite. L i o ie t de la ua tifi atio pa la el-
f ee est u au u e tape, de la p pa atio d ha tillo à l a al se pa spe t o t ie de asse, est o alis e et est do la thode la oi s p ise.
Les thodes de ua tifi atio elati e pa a uage isotopi ue pe ette t d a lio e la
fid lit . Elles so t as es su l ajout d u tag ou l i o po atio d isotope sta le o e le
2H,18O,15N ou 13C. L i o po atio d isotope sta le pe et de o se e les p op i t s ph si o-
hi i ues du peptide e t e la e sio l g e et la e sio lou de. Selo l tape d i o po atio , l e t a tio , la digestio et les tapes de p pa atio s d ha tillo s peu e t être normalisées.
(ii) Marquage isotopique SILAC (ou marquage métabolique)
Dans le SILAC les cellules se développent dans un milieu de culture manquant des acides aminés essentiels. Une version marquée aux isotopes stables (13C ;15N ;2H) de ces derniers est ajoutée
dans le milieu de culture. Introduit en 2002 par Ong et al.229, le milieu de culture était dépourvu
de leucine. De la leucine deutéré a donc été incorporée dans le milieu de culture et a permis la quantification relative de protéines impliquées dans la différentiation de cellules musculaires. Les limites de cette approche sont que tous les peptides tryptiques ne contiennent pas une leucine et ne sont donc pas marqués. De plus le deutérium induit un décalage en temps de rétention230. Pour
pallier au problème de marquage des leucines, les acides aminés les plus couramment utilisés, ai te a t, so t la l si e et l a gi i e. E effet, dans la majorité des cas la digestion enzymatique est alis e a e la t psi e ui laisse l u de es deu a ides a i s e C-terminal du peptide. Le
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ont aussi employés comme les sérines, glycines, méthionines, valines, leucine, histidines et tyrosines231.
Le SILAC peut être multiplexé 3-plex232 ce qui permet de comparer 2 conditions avec une condition
sta da d ou jus u à -plex233,234.
Pour la quantification en tissus, des modèles animaux peuvent aussi avoir un régime spécial
contenant des acides aminés marqués (souris, drosophile, nématode et poisson-zèbre)235 . Mais
la p odu tio d a i au a u s de eu e h e et la o ieuse, e ui li ite les appli atio s.
Figure 36 Principe des méthodes SILAC (a) et super SILAC (b). Les cellules marquées sont utilisées dans ce cas comme standard pour comparer des échantillons. (c,d) chaque colonne représente un nombre de protéines. En combinant 5 types cellulaires (super SILAC) la tumeur est mieux représentée en terme de di e sit s de p ot i es. De plus e,f le supe SILAC pe et l’ide tifi atio de plus de p ot i es a e des CV inférieurs au SILAC. D'après Geiger et al. 2010
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Le SILAC est limité aux échantillons pouvant être marqué métaboliquement mais peut être étendu
aux tissus ou fluides biologiques en utilisa t l ha tillo a u o e u sta da d pou la
quantification (Spike in)236. Pour pouvoir quantifier des tissus humains et notamment des tumeurs,
cette méthode a été étendu et appelé Super-SILAC, en combinant 5 lignées cellulaires différentes afin de représenter au mieux la diversité des tissus237(voir figure 36).
Plus e e t, e ploita t l a a tage de la haute solutio appo t pa les spe t o t es de
masse Hebert et al.238, on introduit le neutron-encoded Neucode SILAC. Neucode est un marquage
métabolique des cellules o e le SILAC ais plutôt ue d utilise des isotopes s pa s d au
moins 4 Da, NeuCode exploite la différence de masse existante entre 13C (+1,0034), 2H (+1,0062)
et 15N (+0,997) pour créer des isotopologues de la lysine (figure 37) séparés au minimum de 6mDa.
Ces isotopoloques sont indifférenciables à un pouvoir de résolution <100 000. Le Neucode a l a a tage de pou oi attei d e u ultiple age de -plexes. Ce marquage a été appliqué avec succès pour la quantification en top-down de plus de 500 protéines de levure (Saccharomyces
cerevisiae) avec deux isotopologues séparés de 36mDa239.
Figure 37 isotopologues de la Lysine commercialement disponibles (gauche) et exemple de spectre de masse pour la quantification multiplexe utilisant des lysines isotopologues
83 (iii) Marquage chimique
(a) Isotope-coded affinity tag reagents (ICATs) :
Les réactifs ICATs ont été introduits en 1999 par Gygi et al240 (voir figure 38) et désignés pour se
lier aux groupements thiol des cystéines au niveau des peptides. Ils sont composés de trois parties : un tag ou ti uette d affi it ui est la ioti e, u l e t de liaiso o a u ou marqué aux isotopes stables (2H ou 13C) et un groupement réactif qui réagit avec les thiols libres
des cystéines. Après digestion, les peptides sont concentrés sur des colonnes de streptavidine, ce qui permet aussi de réduire par un facteur 10 le nombre de peptides241.
La ua tifi atio elati e de ellules sai es et alades se fait pa o pa aiso de l i te sit des peptides entre peptides marqués et non marqués.
Les d sa a tages o e a t l ICATs so t ue la ioti e i te f e pou l ide tifi atio des peptides par les banques de données et rend les peptides plus hydrophobes, ce qui a pour conséquence u ils lue t a e u te ps de te tio p o he. Ce p o l e a t solu par Li et al., en i t oduisa t u l e t de liaiso li a le pa l a ide pe etta t d e le e la biotine. De plus l lutio des peptides ioti il s est pas ua titati e. Fi ale e t, seuls les peptides a a t u e cystéine peuvent être quantifiés, ce à quoi Pan et al., ont proposé une alternative en produisant un réactif ICAT qui catalysé par la trypsine se greffe spécifiquement en N terminale des peptides. Sur le même principe Schimdt et al.242, ont développé un tag (ou étiquette) qui se lie aux fonctions
a i es li es p se te t su les p ot i es et est do pas sp ifi ue d u a ide a i . Co e
le marquage se fait au niveau de la protéine intacte, les conditions testées peuvent être asse l es à u e tape p o e de la p pa atio d ha tillon. Ce tag est appelé Isotope-coded protein labels (ICPL). Ce marquage a été appliqué à la quantification relative ciblée de 6 protéines
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impliquées dans la protection cellulaire dans une lignée cellulaire humaine, afin de mettre en
évidence des composés ali e tai e aug e ta t l a o da e de es p ot i es243.
(b) Tag isobarique :
Deux tags fonctionnant sur le même principe ont été développé le TMTs (tandem mass tags) par Thompson et al.244 en 2003 (commercialisé par Thermo Scientific) et le iTraq ( Isobaric tag for
relative and absolute quantitation) par Ross et al.245 en 2004 (commercialisé par AB Sciex).
Les tags isobariques ne sont pas différentiables dans le spectre MS1, ce qui permet de ne pas complexifier le spectre de masse en combinant différents échantillons. Les tags sont uniquement différentiables au niveau de leur spectre MS2 et la fragmentation des tags permet de remonter à l a o da e elati e des peptides. B
Le tag est constitué de trois parties (voir figure 39) :
- Un groupement ester activé avec le N-hydroxysuccinimide (NHS) qui réagit avec les amines
libres (N-terminal des peptides et lysines) pour former une liaison covalente. Un marquage non specifique peut aussi avoir lieu principalement sur les tyrosines et les serines246.
- Un groupement central servant à contrebalancer la masse du groupement rapporteur afin
d a oi des tags iso a i ues.
- Un groupement rapporteur observable en MS/MS et marqué 13C et/ou 15N pour obtenir
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iT‘AQ et TMT peu e t t e ultiple jus u à et espe ti e e t. Pou le TMT 10-plex une solutio d au oi s 000 à 130 m/z est nécessaire pour pouvoir séparer et quantifier les ions rapporteurs isotopologues séparés uniquement par 6,32mDa247,248. Une des limites de cette
approche est le possible co-isole e t et f ag e tatio d u io a a t u appo t /z o p is
da s la fe t e d isole e t e ui a pou o s ue e d i te f e a e la esu e des atios
comme illustré figure 40. Ting et al.249, o t o t ue d ajoute u e tape de s le tio et de
f ag e tatio MS pe ettaie t d li i e p es ue toutes les i te f e es, l ide tifi atio se fait à partir des spectres MS et MS2 et la quantification avec le spectre MS3 (voir figure 40).
Figure 39 Les réactifs TMT utilisé pour les analyses multiplexes. Les atomes portant un marquage isotopique sont indiqués par une astérisque.
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fragments uniques pe etta t u aug e te la ualit des do es d ide tifi atio . La aleu de
NCE ai si ue la ga e de asse o t aussi t opti is es pe etta t d aug e te de à %
le nombre de peptides phosphorylés quantifié.
Une alternative récente aux TMT et iTRAQ pe etta t de s aff a hi des p o l es
d i te f e es est le d eloppe e t du EASI-tag par Virreira Winter et al254 qui permet une
quantification 6-plex . L o igi alit de e TAG est u e f ag e tatio à plus asse e gie e HCD
que le TMT et le iTRAQ résultant en une perte de neutre et la conservation intact de la structure peptidique (voir figure 41).
(c) 18O labelling:
Cette méthode présentée en 2001255pe et l i t odu tio de deu isotopes d o g e e C-
terminale des peptides (figure 42). La réaction est catalysée par les protéases à sérine comme la trypsine, glu-C ou lys-C e p se e d eau H218O. Cette méthode universelle applicable à tout type
d ha tillo pe et de a ue tous les peptides de a i e u ifo e et o o i ue. E revanche, seulement deux états peuvent être comparé à la fois et le marquage se fait au niveau des peptides, ce qui ne permet pas de normaliser la digestion.
Figure 41 Représentation du réactif EASI-tag, les atomes portant un marquage isotopique sont indiqués par une
astérisque(gauche). Compa aiso du tau de f ag e tatio des tag EASI et TMT pa HCD d oite . D’ap s Vi ei a Wi te et al. 2018
Figure 42 S h a a tio el d’i se tio de H218O lo s de la digestio à la t psi e d’u e p ot i e. D’ap s Yao et al.
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Plus récemment Wang et al., ont proposé une variante en alkylant les cystéines avec de l iodoa ta ide a u à l o g e . L a a tage est ue le a uage se fait au i eau de la protéine mais uniquement les peptides contenant une cystéine peuvent être quantifiés.
(d) Dimethyl labelling:
Introduit en 2003 par Hsu et al.256 ce marquage est économique et applicable à tout type
d ha tillo s257. U g oupe e t di th le s atta he e N-te i ale des peptides et su l a i e
libre des lysines. Le marquage peut se faire en solution256 ou sur colonne et en ligne258.
Cette thode peut t e ultiple e jus u à fois259(voir figure 43).
Lau et al.260, ont comparé les performances du SILAC et du diméthyl labelling (DML) pour la
quantification de protéines provenant de cellules HeLa. Trois conditions de marquage (DML) ont aussi t test es afi d alue l effi a it des diff e tes thodes de a uage e ista tes. Les trois conditions sont : en solution et marquage et sur colonne acidifiée ou non. Le marquage sur colonne non acidifiée est le plus efficace et a donc été comparé au SILAC. En termes de performance, le DML conduit à 23% de peptides en moins identifiés en comparaison avec le SILAC. L tape de a uage se fait su des stageTips C e ui a pou o s ue e u e pe te des peptides hydrophiles. Un autre avantage du SILAC est que les cellules sont combinées à un stade
Figure 43 Ma uage DML fois ultiple pa l’ajout de Ca o e C et de deutérium. Représentation schématique de la comparaison de 5
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précoce, les étapes de digestion et de déssalage sur colonne sont normalisées contrairement au DML. Ce qui a pour conséquence une meilleure fidélité avec des standards de déviation en log2 de 0,175 contre 0,255 et une répétabilité du SILAC 4 fois supérieure au DML avec des standards de déviation de 0,0591 contre 0,204 pour le DML.
Conclusion : Les approches de quantification relative présentées dans cette partie sont majoritairement utilisées en combinaison des approches bottom-up. En effet, les marquages
hi i ues o e l iT‘AQ, le TMT, EASY-Tag et le DML ont été optimisé pour être utilisé au niveau
des peptides. Bien que comme montré par Hung et al., le TMT semble pouvoir être utilisé pour marquer des protéines. Ces approches permettent de quantifier des modifications post- traductionnelles. Mais comme la quantification se fait au niveau du peptide (bottom-up) ces app o hes so t li it es pou l tude des p ot ofo es. Le SILAC a été couramment employé en combinaison des méthodes bottom-up apportant une meilleure fidélité que les marquages hi i ues a l tape de digestio est o alis e. Le SILAC a aussi t alu pou les app o hes
top-down261,262 bien que des limitations existent principalement concernant le taux
d i o po atio des a ides a i s lou ds ui est d pe da t de la taille des p ot i es. Le SILAC
pou aie t a oi u i t t pou l tude des p ot oformes.
b) Quantification absolue des protéines
Les méthodes de quantification relative des protéines permettent de quantifier une protéine de manière fidèle. En revanche, la valeur absolue de la protéine ne peut pas être déterminée car il manque un étalon interne permettant de rendre la méthode juste. Cet étalonnage avec un étalon a a t is pe et de d eloppe des thodes de ua tifi atio a solue. Pou u u e thode de ua tifi atio a solue soit alid e, elle doit t e e a te est-à-dire juste et fidèle comme illustré figure 44. Alors que les méthodes de quantification relative doivent avoir uniquement une o e fid lit . La justesse o espo d à l a t esu pa appo t à u e aleu de f e e et la fidélité à la dispersion des valeurs mesurées obtenues par des mesures répétées.
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Les méthodes de quantification absolue utilisent un étalon interne lourd qui sert à la
quantification et doit être au plus proche de la protéine endogène à quantifier. Les différents talo s lou ds, ai si ue leu tape d i se tio da s la p pa atio d hantillon, sont illustrés dans la figure 45 ci-dessous263 :
91 (i) Principe et standards internes
Les app o hes e pos es p de e t s i t esse t à o pa e u ou plusieu s ha tillo s
avec une référence sans donner une concentration exacte. La quantification absolue des protéines pe et d o te i la aleu de o e t atio totale de la p ot i e et doit être fidèle et juste. Les performances de la méthode sont dépendantes du choix de peptide, du type de marquage et de la calibration.
(a) Principes généraux : Choix du peptide
En premier lieu, concernant les approches par bottom-up un ou plusieurs peptides par protéine doit être choisit. Les peptides sélectionnés pour la quantification doivent être quantotypiques