Chapitre 1 : Quantification de protéines impliquées dans la physiopathologie des DFT Apport du
IV. Discussion et perspectives
La p e i e ause des DFT fa iliale est u e e pa sio d u he anucléotide (G4C2)n dans le gène
C9ORF72. Trois hypothèses, non concurrentes, ont été proposées pour les mécanismes de toxicité
engendrée par cette expansion : u e haploi suffisa e de la C O‘F , la fo atio de fo i d A‘N
et la production de protéines dipeptides. Dans ce manuscrit nous nous sommes intéressés à développer des outils analytiques pour la quantification des isoformes de la C9ORF72. En effet, jus u à p se t ette ua tifi atio tait alis e u i ue e t pa Weste Blot à partir
da ti o ps o o e iale e t dispo i les, e ui li ite la ep odu tio des a al ses da s
différents laboratoire. De plus, la spécificité de ces anticorps est discutable en effet, Xiao et al., o t d te t l isofo e C -S dans le cortex frontal contrairement à Frick et al. Nous avons eu donc pour but de développer une méthode par spectrométrie de masse permettant la quantification de ces deux isoformes. Cette méthode a été appliquée à une cohorte comprenant des témoins, des cas sporadiques avec inclusions TDP-43 et des DFT avec expansion C9, dans le cortex frontal. Les résultats ont montré une diminution de la C9-L en comparaison des témoins et des cas
sporadiques avec inclusions TDP- . E e a he ous a o s pas pu d te te et ua tifie
l isofo e C -S qui est sous la limite de détection de notre méthode. Nous avons alors étendu l appli atio de ot e thode à diff e ts t pes ellulai es ai si u au PBMCs. La méthode doit être améliorée pour être appliquée au suivi du niveau de la C9ORF72 en cellules331 . En revanche
elle peut être appliquée à la quantification de la C9ORF72 dans des e eau d a i au afi de
sui e l effet d u t aite e t o t e l haploi suffisa e de la C O‘F soit estau a t so i eau ou e aug e ta t l effi a it de sa fonction331.
Nous avons pu répondre, sans ambiguïté, à la question de la diminution de la C9-L dans le cortex f o tal. N a oi s, ous a o s pas pu o lu e de a i e satisfaisa te pou la C -S. Les points d a lio atio de la thode o t t e dis ut s.
- Dans notre méthode de quantification des isoformes par différence, les biais des peptides
s additio e t e ui e ous pe et pas de ua tifie u isofo e i o itai e309 (<20%).
Ce qui montre la limite de cette approche de quantification indirecte. Il faudrait alors quantifier le peptide unique de la courte. L a al se de e peptide, e plus de pe ett e la ua tifi atio di e te de l isofo e ou te pourrait se relever intéressant du fait de phosphorylations observées en cellules HEK. Ce peptide est plus long que les peptides tryptiques classiquement analysé. En effet, il est composé de 31 acides aminés (3.3 kDa). Pour son analyse une colonne de type C8, C4 ou Zorbax C3 pourrait être plus appropriée175.
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Enfin, le rendement SPE pour ce peptide était le plus faible des quatre peptides, une optimisation des conditions pour ce peptide serait pertinente. Une approche par SISCAPA pourrait aussi être développée e e pla e e t de l tape de SPE. E effet, ette
méthode présentée en introduction (II-2) pe et d attei d e des limites de quantifications
proche du ng/mL. De plus, une plus grande quantité de tissus cérébrale pourrait être analysée sans augmenter les effets matrices.
- La quantification par top-down est-elle envisageable ? Premièrement, la taille des isoformes de la C9ORF72 est de 25 kDa et de 54 kDa. La C9-S rentre dans la gamme de masse des protéines facilement analysable par top-down (Introduction II-3) alors que la C9-L est au-dessus > kDa . Les o ditio s d io isatio s et d a al se pa spe t o t ie
de asse de o t do t e pa ti uli e e t opti is es pou l a al se de la C -L. De
e ue pou les o ditio s h o atog aphi ues a e l utilisatio de olo es monolithiques, C4 ou Zorbax C3. Une fois ces conditions optimisées une attention
particulière de a t e po t e à l e t a tio de la C O‘F de la at i e iologi ue. E
effet, e est pas u e protéine majoritaire du cerveau comme montré par nos analyses
a e des o e t atio s de l o d e de g/ L ap s l se, l e t a tio doit do t e
sélective pour les analyses par top-down. La méthode GelFrEe développée par le groupe de Kelleher205 pourrait être envisagée mais cette méthode semble plutôt être adaptée
pou des a al ses p ot o i ues. Le d eloppe e t d u e i u op ipitatio , e ue
ous a o s pas ussi, pe ett ait l e t a tio s le ti e de la C O‘F . Pou ela, l utilisatio d u nouvel anticorps est requise comme par exemple celui récemment publié
par Frick et al330. L i u op ipitatio est oins gênée par les effets matrices donc la
quantité de tissus pourrait être augmentée afin de gagner en sensibilité. De plus, une méthode top-down suffisamment sensible permettrait la quantification directe des deux
isoformes ai si ue la e he he d autres modifications post-traductionnelles encore non
décrites.
La méthode que nous avons développée va être appliquée à la quantification de la C9ORF72 à d aut es régions du cerveau qui ne sont pas impactées par la DFT comme montré, par les résultats préliminaires obtenus, avec le lobe occipital. Cela permettra de faire une cartographie du niveau
des isoformes de la C9ORF72 et de chercher la présence lisofo e C -S dans différentes régions
cérébrales. Il se ait aussi i t essa t d i lu e les p ot i es ua tifi es a e la thode
multiplexe afin de voir si les modifications du niveau de ces protéines sont dépendantes de la région cérébrale.
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La C9O‘F a pas pour but d t e u biomarqueur diagnostic car le diagnostic est déjà réalisé
pa ua tifi atio du o e d e pa sio . Afi de ieu o p e d e la ph siopathologie des
DFT, de t ou e des io a ueu s pote tiels d olutio ou des i les th apeuti ues ous a o s développé une méthode de quantification multiplexe par bottom-up de 49 protéines. Nous avons trouvé 19 protéines impactées dans les DFT en comparaison avec des témoins. Une méthode ciblée de ces 19 protéines pourrait être développée pour leur quantification dans le LCR ou le plasma. La sensibilité de la méthode pourrait être améliorée en utilisant une chaine nano-LC avec u e p pa atio d ha tillo plus s le ti e. La digestio des p ot i es pou ait aussi t e optimisée afin de gagner en sensibilité et fidélité.
Le gène C9ORF72 est particulièrement intéressant puis u il fait le lien entre les DFT et les SLA
(DFT-> ALS et DFT+ALS)332. Dans le cas des DFT le cortex frontal est touché alors que pour les SLA
ce sont les neurones moteurs332. Il se ait alo s i t essa t d ide tifie des protéoformes de la
C9ORF72 qui pourraient être différents entre les deux maladies et représentatif de ces maladies. Les protéines dipeptides p oduites pa la t adu tio de l e pa sio so t des io a ueu s potentiels337,376. Leurs analyses par spectrométrie de masse semblent être un challenge pour
plusieu s aiso s. P e i e e t, l h t og it de la taille de l e pa sio ui est de plusieu s
dizaine à plusieurs milliers de répétition. Cette hétérogénéité va être traduite au niveau de la protéine et rendre son analyse par des méthodes ciblées de spectrométrie de masse difficile. De plus, au moins 6 protéines sont produites avec des propriétés physico-chimique différents en effet certaines formes sont très hydrophobes (GA)n alors que les formes (PR)n et (GR)n vont être plutôt
hydrophiles. Les (PR)n et (GR)n ont une s ue e p opi e à l io isatio pa ele t osp a . Ces deux
protéines vont être extrêmement chargées positivement ce qui pourrait être un avantage pour la p pa atio d ha tillo , pa e e ple SPE échange de cations. Bie ue l a al se pa spectrométrie de masse ne semble pas optimale il y a un réel intérêt à développer des méthodes de caractérisation de ces protéines.
Perspectives plus globales :
La TDP-43 est une protéine qui forment des inclusions neuronales dans les maladies
eu od g ati es, les DFT e pa ti ulie , au e tit e ue la p ot i e tau et l alpha-
synucléine. La TDP- est pas u e p ot i e ajo itai e du e eau o e l alpha-synucléine et
une méthode par top-down par simple précipitation des protéines ne semble pas être adaptée. Plusieurs modifications, comme des troncations ou phosphorylations, sont connues comme augmentant la capacité de la TDP-43 à former des inclusions, notamment en induisant un
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changement de sa localisation377. De plus, la TDP-43 à des propriétés de prion378,379 o e l alpha-
s u l i e. Du fait de la si ila it e t e es deu p ot i es le d eloppe e t d u e thode
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