Le TGF-β (facteur de croissance transformant)

Le TGF-β est un facteur de croissance qui joue un rôle clé dans de nombreux contextes physiologiques et pathologiques dont la cicatrisation des plaies et la fibrose pulmonaire. Depuis sa découverte en 1983, plus de 30 membres de la famille du TGF-β (TGF-βs, activines et BMPs) ont été identifiés (Frolik et al., 1983). Les trois isoformes du TGF-β possèdent une forte homologie entre eux, chacun possède un nœud cystéine conservé et des fonctions similaires. Des 3 isoformes du TGF-β qui existent chez les mammifères, le TGF- β1 joue le rôle le plus important dans le système immunitaire, particulièrement dans le contrôle de la prolifération, l'activation et la différenciation des lymphocytes T (Shull et al., 1992). Des études visant à définir le rôle du TGF-β dans la PR ont donné des résultats mitigés, le TGF-β1 pourrait agir comme inhibiteur ou promoteur de la réponse inflammatoire. En effet, des études ont rapporté que l'administration intrapéritonéale de TGFβ1 réduit la sévérité de l'arthrite chez la souris CIA, en particulier si l'injection est faite dans les derniers stades de la maladie (Kuruvilla et al., 1991; Santambrogio et al., 1993). Par contre, d’autres études ont démontré des résultats opposés. Il a été montré que des injections répétées de TGF-β1 chez des souris saines induisent une inflammation articulaire et une hyperplasie de la membrane synoviale (van Beuningen et al., 1994). De même, l'injection intra-articulaire de TGF-β1 au rat induit un recrutement de neutrophiles, une hyperplasie synoviale et une infiltration de cellules immunitaires dans l’articulation (Allen et al., 1990; Fava et al., 1991).

Les membres de la famille du TGF-β initient leurs actions cellulaires en se liant à des récepteurs ayant une activité sérine/thréonine kinase. Cette famille de récepteurs se compose de deux sous-familles, les récepteurs de type I (TΒRI) et de type II (TΒRII), qui sont structurellement similaires, avec de courtes régions extracellulaires riches en cystéines et des régions intracellulaires constituées principalement des domaines kinases. Chaque membre de la famille TGF-β se lie à une combinaison caractéristique de TΒRI et TΒRII, qui sont tous deux nécessaires pour la signalisation. Le complexe de signalisation est un hétérotétramère composé de deux TΒRI et deux TΒRII. Une étape importante dans l'activation du récepteur est la phosphorylation de ce tétramère. La voie de signalisation intracellulaire canonique induite par le TGFβ est médiée par les protéines de la famille des SMADs. Basé sur leurs différentes fonctions, les SMADs sont divisés en trois groupes, les SMADs associés aux récepteurs (R-SMADs), les SMADs co-opérateurs (Co-SMADs) et les SMADs inhibiteurs (I-SMADs) (Ross et Hill, 2008). Seul les R-SMADs sont phosphorylés par le TΒRI activé. En général, les divers TGF-β activent différentes combinaisons de TΒRI ou de TΒRII à la membrane plasmique et ciblent les R-SMADs de façon spécifique pour leur activation (Heldin et al., 1997; Ross et Hill, 2008). Le TΒRI actif induit la phosphorylation des R-SMADs, SMAD2 et SMAD3, qui vont alors former un complexe avec le Co-SMAD, SMAD4. Le SMAD4 agit comme transducteur central dans les réponses du TGF-β et aide à la translocation du complexe (SMAD2/3-SMAD4) au noyau où il active la transcription des gènes. Le I-SMAD, SMAD7, permet un contrôle de la signalisation. Il peut entrer en compétition avec les Co-SMADs pour l'interaction avec les R-SMADs phosphorylés et peut recruter SMURF E3, une ubiquitine ligase pour le TΒRI (Itoh et ten Dijke, 2007; Kavsak et al., 2000).

La diversité des réponses de signalisation du TGF-β est déterminée par la combinaison de la voie de signalisation des SMADs avec d'autres voies de signalisation (voies non- SMADs). Les modes d'action des voies non-SMADs peuvent être classés en trois catégories (Moustakas et Heldin, 2005). Premièrement, les voies non-SMAD qui modifient directement la fonction des SMADs, par exemple, l’activation du TBR peut activer la kinase ERK qui par la suite inhiber l’activité des R-SMADs (M. K. Lee et al., 2007)(figure 8 voie 1). Puis, les protéines non-SMAD dont les fonctions sont directement modulées par

SMAD et qui transmettent des signaux à d'autres voies de signalisation (figure 8 voie 2). Finalement, les protéines non-SMAD qui interagissent ou deviennent phosphorylées directement par les TΒR et ne touchent pas nécessairement la fonction des SMADs (figure 8 voie 3). Par exemple, le TGF-β peut activer la petite GTPase RhoA pour induire la formation de fibre de stress d'actine pendant la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) (Bhowmick et al., 2001). Les protéines non-SMAD comprennent également la kinase c-Jun NH2- terminale (JNK), la p38 de la protéine kinase activée par un mitogène (MAPK) et la PI3K (Moustakas et Heldin, 2005).

Figure 8 Signalisation non-SMAD du TGFβ

Les protéines non-SMAD peuvent modifier la fonction d’un SMAD, être modulés par les SMAD ou être activés par le TBR.

4 Les invadosomes dans la polyarthrite rhumatoïde

La formation des invadosomes par les synoviocytes de type fibroblastique provenant d’arthrite est un nouveau champ d’étude dans le domaine de l’arthrite. La découverte de ces structures dans les FLS a été effectuée par notre groupe de recherche en 2011. Premièrement, il a été démontré que les synoviocytes arthritiques forment des quantités plus importantes d’invadosomes que les synoviocytes sains et que cette formation est orchestrée par Src. Nous avons montré que les invadosomes des FLS contiennent des molécules de signalisation, telles que Src actif et les métalloprotéinases MMP-3 et MMP- 13, qui sont associées à des lésions du cartilage. En effet, il a été observé que les niveaux

de Src actif sont plus élevés dans les synoviocytes arthritiques comparativement aux synoviocytes sains et que l’inhibition de Src diminuait la production des invadosomes ainsi que la dégradation de la matrice extracellulaire in vitro. De plus, l’inhibition pharmacologique ou à l’aide d’un shRNA dirigé contre Src dans un modèle animal d’arthrite (arthrite induite au collagène chez le rat) a permis de diminuer l’hyperplasie de la membrane synoviale ainsi que l’invasion et la dégradation du cartilage. Cette étude a mis en évidence pour la toute première fois que la formation d'invadosomes par les FLS arthritiques mène à une dégradation de l’ECM in vitro et in vivo, en outre associant les invadosomes à des dommages articulaires (Lauzier et al., 2011). Par la suite, nous avons démontré que la transglutaminase 2 (TG2), une enzyme impliquée dans le remodelage de l’ECM, était impliquée dans la dégradation du cartilage des articulations dans un modèle animal d’arthrite (CIA chez le rat). En effet, une augmentation de l’activité TGase ainsi qu’une augmentation de l’expression de la TG2 dans l’ECM ont été observées dans les cultures de FLS arthritiques comparativement aux FLS sains. De plus, nous avons démontré pour la première fois que la production d’invadosomes était liée à l'activité TGase de la TG2 et que cet effet dépendait de la signalisation du TGF-β (Lauzier et al., 2012). Plusieurs études récentes impliquent également la TG2 et le TGF-β comme régulateurs de la transition épithélio-mésencymateuse (EMT) (Cao et al., 2012; Fisher et al., 2015; Park et al., 2013). En effet, il a été démontré que l'expression de l’α-SMA (alpha smooth muscle actin) dans les fibroblastes synoviaux de patients atteints de PR est régulée par l'addition de TGF-β (Mattey et al., 1997; Watson et al., 2010). L’α-SMA est un marqueur de myofibroblastes, un stade plus dédifférencié des FLS. À la lumière de ces résultats, nous nous sommes intéressés au processus d’EMT dans les FLS. Nous avons démontré que parmi 84 gènes associés à l’EMT, seul le facteur de transcription Snai1 (Snail) était significativement augmenté chez les FLS arthritiques comparativement aux FLS sains. Par la suite, nous avons démontré que Snail était essentiel pour la dégradation de l'ECM par les cellules synoviales humaines et de rats et pour la dégradation du cartilage in vivo. Du point de vue mécanistique, Snail réprime PTEN, ce qui entraîne une augmentation de la phosphorylation du PDGFR et l'activation de la voie de signalisation PI3K/Akt (Lauzier et al., 2016).

La formation d’invadosomes est un processus physiologique important dans le développement de l’arthrite. Jusqu’à présent, nous savons que l’axe SNAI1-PTEN PDGFR/PI3K est un régulateur important du phénotype destructeur des synoviocytes de type fibroblastique via la formation des invadosomes. Les thérapies actuelles pour la polyarthrite rhumatoïde ciblent l’inflammation et ne sont que partiellement efficaces pour à contrer les lésions articulaires. Le développement de nouvelles thérapies ciblant directement la formation des invadosomes des synoviocytes pourraient possiblement augmenter l’efficacité des traitements actuels.

HYPOTHÈSE/PROBLÉMATIQUE

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie chronique, systémique, inflammatoire et auto- immune qui attaque principalement les articulations synoviales, entraînant une destruction articulaire et une incapacité fonctionnelle. Le développement de la PR est marqué par une transformation du tissu synovial qui devient hyperplasique et se transforme en un tissu invasif détruisant le cartilage articulaire et l'os. Des études ont indiqué que les synoviocytes de type fibroblastique sont les principaux effecteurs de la destruction des articulations via la production des invadosomes. Par contre, les mécanismes impliqués dans la formation d’invadosome par les FLS ne sont pas entièrement connus. Il est reconnu que les synoviocytes sont activés par certains facteurs de croissance, dont le FGF et le PDGF, qui agissent via des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTKs). Nous avons donc émis l’hypothèse que l’activation des RTKs est nécessaire au phénotype invasif des FLS.

Objectifs

L’objectif principal de mon projet de maîtrise consistait donc à déterminer le rôle potentiel des RTKs dans la biogenèse des invadosomes par les synoviocytes. Dans un premier temps, nous devions identifier le ou les RTK(s) impliqués dans l’initiation de la production des invadosomes. Suite à l’identification du PDGFR comme étant le principal RTK favorisant le phénotype agressif des FLS, nous voulions déterminer quelle(s) voie(s) de signalisation était impliquée(s) dans formation d’invadosomes en aval du PDGFR. Finalement, ces observations nous ont menés à l’étude de la relation entre le TGF-β et le PDGFR dans la formation des invadosomes.

Platelet-derived growth factor receptor activation promotes the pro-destructive invadosome-forming phenotype of synoviocytes from patients with rheumatoid

arthritis

Martine Charbonneau1_{, Roxane R. Lavoie}1, _{Annie Lauzier, Kelly Harper, Dr.Patrick P.}

McDonald et Dr. Claire M. Dubois

1_{Co-premier auteur}

Article publié dans The Journal of Immunology, 196(8):3264-3275 (2016).

Avant-propos: Les expériences présentées dans cet article ont été effectuées par Martine Charbonneau (Figure 2A-D, 3A-F et 4A-C), Roxane R.Lavoie (Figure 5A-E, 6A,B,E et 7A-E) et Annie Lauzier (Figure 1A-C, 6C et D). La rédaction de cet article à été majoritaire effectuée par Dr. Claire M. Dubois, Martine Charbonneau et Roxane R.Lavoie avec la collaboration des autres auteurs.

Résumé : Les synoviocytes de type fibroblastique (FLS) jouent un rôle majeur dans la destruction articulaire dans la polyarthrite rhumatoïde (PR). Ce phénotype destructeur implique l’activation autocrine du TGFβ menant la formation des invadosomes, par contre, les mécanismes moléculaires associés ne sont pas encore complètement élucidés. Il a été démontré que la famille du PDGFR, un récepteur à activité tyrosine kinase (RTK), peut coopérer avec le TGFβ dans diverses pathologies. Nous avons voulu déterminer si l'activité des RTK joue un rôle dans la biogenèse des invadosomes. Nous avons démontré que, parmi les RTK les plus communs, le PDGFR-αβ est spécifiquement phosphorylé chez les FLS de patients atteints de la PR. La phosphorylation du PDGFR-αβ est également élevée dans les tissus synoviaux de ces patients. L'inhibition de l'activation du PDGFR inhibe la formation d’invadosomes dans les synoviocytes arthritiques, indiquant la présence d'une boucle d'activation autocrine du PDGFR qui implique le PDGF endogène. Parmi les isoformes PDGFA-D, seul le PDGF-B a été trouvé à la fois significativement élevé dans les lignées FLS de patients atteints de PR et lié à des cellules formant des quantités élevées d’invadosomes. L’ajout de TGFβ augmente la formation d’invadosome, l’expression de l’ARNm du PDGF-B ainsi que la phosphorylation du PDGFR. Toutes ces fonctions sont efficacement supprimées par l’inhibition du TGFβ ou par l’inhibition des voies Smad/TβR1 ou PI3K/Akt. Parmi les membres de la famille des PI3K de classe 1 exprimés par les synoviocytes arthritiques, le PI3Kα est sélectivement impliqué dans l'expression de PDGF- B alors que le PI3Kα et PI3Kδ participent à la formation des invadosomes. Nos résultats démontrent que le PDGFR est le principal RTK impliqué dans le phénotype invasif des cellules synoviales de PR. Ils fournissent également des preuves d'une association entre le TGFβ et le PDGFR dans la formation des invadosomes par les synoviocytes qui implique la production de PDGF-B induite par TGFβ.

ABSTRACT

Fibroblast-like synoviocytes (FLS) play a major role in invasive joint destruction in rheumatoid arthritis (RA). This pro-destructive phenotype has been shown to involve autocrine TGF that triggers formation of matrix-degrading invadosomes through molecular mechanisms that are not fully elucidated. The PDGFR family of receptor tyrosine kinases (RTK) has been shown to cooperate with TGFin various pathological conditions. We therefore sought to determine whether RTK activity played a role in invadosome biogenesis. We demonstrated that, among the common RTKs, PDGFR- was specifically phosphorylated in FLS from RA patients. Phosphorylation of PDGFR- was also elevated in RA synovial tissues. Interference with PDGFR activation or PDGF neutralization inhibited invadosome formation in RA synoviocytes, indicating the presence of an autocrine PDGFR activation loop that involved endogenous PDGF. Among the PDGFA-D isoforms, only PDGF-B was found both significantly elevated in FLS lines from RA patients, and related to high-invadosome forming cells. Addition of TGFupregulated invadosome formation, PDGF-B mRNA expression, and phosphorylation of PDGFR. All these functions were efficiently suppressed by TGFneutralization or interference with the Smad/TR1 or PI3K/Akt pathway. Among the class 1 PI3K family proteins known to by expressed in RA synoviocytes, PI3Kα was selectively involved in PDGF-B expression while both PI3Kα and PI3Kδ participated in invadosome formation. Our findings demonstrate that PDGFR is a critical RTK required for the pro-destructive phenotype of RA synovial cells. They also provide evidence for an association between autocrine TGFand PDGFR-mediated invadosome formation in RA synoviocytes that involves the production of PDGF-B induced by TGF.

KEY WORDS

PDGFR, PDGF-B, TGFreceptor tyrosine kinase, PI3K-AKT, Smads, invadosomes, invadopodia, podosomes, synovial cells, synoviocytes, fibroblast-like synoviocytes, cartilage degradation, rheumatoid arthritis, PI3Kα, PI3Kδ.

INTRODUCTION

Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease that mainly affects the joints, leading to joint inflammation and erosive structural damages. Although important progress has been made in managing the pain and inflammation associated with the disease, strategies to directly interfere with the process of erosion are lacking. The onset of RA causes important morphological changes in joint lining, including formation of an aggressive tumor-like synovial tissue that invades and erodes cartilage and bone(1). A large body of evidence from patients and experimental animal models indicated that fibroblast- like synoviocytes (FLS) are the main cell type that actively drives inflammation and joint destruction(2-4). Arthritic FLS resemble transformed mesenchymal cells which are highly invasive in vitro and in vivo. This property correlates with elevated production of inflammatory cytokines and proteolytic enzymes which sustain inflammation and joint matrix degradation. We have reported that the ability of arthritic FLS to degrade the extracellular matrix depends on the formation of plasma membrane structures that resembled invadopodia in tumor cells(5, 6). These structures were detected in fibroblast- like cells strategically located at the cartilage-synovial membrane interface. They were shown to contain actin components, signaling molecules, such as Src, and high levels of proteolytic enzymes known to be particularly efficient at inducing cartilage damage. Importantly, interference with the formation of invadosomes in arthritic FLS strongly inhibited matrix degradation in vitro and ex vivo as well as cartilage degradation in a rat model of arthritis(5, 6). These observations suggested that invadosomes were directly involved in joint degradation, leading to the conclusion that an in-depth understanding of the mechanism of invadosome formation is of importance for development of joint protection strategies for the clinical management of RA.

The mechanisms involved in invadosome formation in synovial cells are not fully known. We have reported that invadosome formation and in vivo cartilage degradation capability of synovial cells of collagen-induced arthritis rats depend on an autocrine activation loop that involved TGF(6). Analysis of the protein and mRNA in RA synovial tissues revealed that TGF was highly expressed in RA patients (7-9). However, few studies have addressed the role of TGF in the functions of synovial fibroblasts derived from these patients. TGF

was shown to increase the expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinases in RA synoviocytes (9), an effect that was found to be dramatically potentiated by receptor tyrosine kinase (RTK)-dependent signaling (10). These studies suggested a potential association between TGF and RTK signaling to promote pro- arthritic functions of synovial fibroblasts.

RTKs comprise a large family of cell-surface receptors that are essential components of signal transduction pathways that mediate cell survival, proliferation, differentiation, motility and modulate cell metabolism(11). These transmembrane proteins bind polypeptide ligands, mainly growth factors. Among the 58 RTK family members, epidermal growth factor receptor (EGFR), platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), fibroblast growth factor receptor (FGFR), vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), hepatocyte growth factor receptor (HGFR; c-Met) and stem cell growth factor receptor (c-kit), have been shown to be expressed in rheumatoid synovial tissues (11- 19). On the basis of their roles as growth factor receptors, several RTKs are the driving force for onset or progression of various diseases such as malignancy and arthritis and may represent key targets in therapeutic treatments. For instance in the case of arthritis management, immatinib mesylate, a tyrosine kinase inhibitor initially used for treatment of chronic myeloid leukemia, has been shown to reduce activation of RA synoviocytes by interfering with PDGFR signaling(10, 20). In experimental arthritis, imatinib has also been reported to markedly reduce joint erosion when administered before onset of the disease or during its progression (20-22). In RA patients, several reports have confirmed the efficacy of imatinib and this has lead, in some cases, to complete clinical remission (23-26). Despite these encouraging results, the toxicity of imatinib was found to be high (27), possibly due to its pan-effect on multiple RTKs. The bulk of these observations suggested that identification of RTKs specifically involved in joint erosion would be invaluable to design specific strategies for development of targeted therapies to minimize or prevent joint damage in RA.

The goal of the current study was to investigate whether RTKs played a role in invadosome formation by synovial cells and to identify the nature of these RTKs. RTKs such as

PDGFR, hepatocyte growth factor receptor and epidermal growth factor receptor have been shown to direct matrix degradation and cell invasion, a situation linked to invadosome formation in cancer cells (28-31). Here, we show that activation (phosphorylation) of PDGFR is specifically upregulated in RA synoviocytes and synovial tissues. We also show that PDGFR activation involves TGF-induced PDGF-B upregulation mediated by TR1/Smad and PI3K/AKT pathways. These findings suggested the involvement of an overreactive TGF-/PDGF-B/PDGFR pathway in synoviocyte-driven extracellular matrix degradation in RA.

MATERIAL AND METHODS FLS cell lines

Human synovial cells derived from joint tissues (mostly knee joints) of patients diagnosed with osteoarthritis (OA), rheumatoid arthritis (RA) or from control non-arthritis individuals (NA) were purchased from Asterand (Detroit, MI). The 1987 ACR or 2010 ACR/EULAR classification criteria were used for diagnosing RA (32, 33), while the OA patients were classified using the 1986 ACR clinical criteria for OA (34). The NA cell lines were derived from synovial tissues of cadavers who died from cardiovascular diseases. All synovial tissues were obtained under approval of the local Institutional Review Board and appropriate signed informed consent. Human synovial tissue samples used for immunohistochemistry were obtained from OA or RA patients undergoing total knee joint replacement surgery. The 1987 ACR or 2010 ACR/EULAR classification criteria were