S. xylosus et S. carnosus sont principalement utilisés dans les produits carnés fermentés pour leur contribution au développement de la couleur rouge, typique de ces produits. Les sels nitratés utilisés comme sels de saumurage sont réduits en nitrites par l’activité nitrate réductase de ces ferments. Le nitrate importé par la bactérie est réduit en nitrite. Ce dernier est excrété. Quand la concentration de nitrate devient limitante, le nitrite est réimporté et réduit en ammoniaque via la nitrite réductase. La nitrate réductase est une enzyme membranaire tandis que la nitrite réductase est cytosolique (Neubauer and Götz 1996). Le catabolisme du nitrate et du nitrite a été bien étudié chez S. carnosus (Neubauer and Götz 1996).
1) La nitrate réductase
1.1) L’opéron nar
Les gènes codant cette enzyme sont organisés en opéron, appelé l’opéron nar, pour les deux espèces S. carnosus et S. xylosus (Figure 11).
L’opéron nar a été particulièrement bien décrit chez S. carnosus TM300 (Pantel et al. 1998). Cet opéron est constitué de quatre gènes narGHJI qui se chevauchent et sont organisés en une seule unité transcriptionnelle (Pantel et al. 1998). Pour ces 4 gènes, une région promotrice
terminaison est absent à la fin de l’opéron (Pantel et al. 1998). Chacun des gènes code une sous-unité de la nitrate réductase, les sous-unités α, β, δ et γ, respectivement (Pantel et al. 1998).
Le gène narG code la grosse sous-unité α de l’enzyme (138,4 kDa) qui possède un site de liaison au cofacteur molybdène. Le gène narH code la sous-unité β (59,9 kDa) possédant 4 clusters [Fe-S] coordonnés par des cystéines et qui est impliquée dans le transfert d’électron. Le gène narJ code la sous-unité δ (22,6 kDa) indispensable à l’activité nitrate réductase. En effet, une mutation dans ce gène obtenue par insertion d’un transposon induit la perte de la capacité de S. carnosus à réduire les nitrates (Blasco et al. 1992). Le gène narI code la sous-unité γ (26,4 kDa) qui a 5 segments transmembranaires. Chez S. carnosus, un mutant obtenu par insertion d’un transposon dans ce gène montre aussi une perte de sa capacité à réduire le nitrate (Pantel et al. 1998). Un gène nommé narT situé en aval de l’opéron nar a été identifié chez S. carnosus (Fast et al. 1996, Fedtke et al. 2002). Chez S. carnosus, la protéine NarT est transmembranaire (42 kDa) mais son rôle n’est pas clairement déterminé. Il semble que NarT importe le nitrate et exporte le nitrite (Fast et al. 1996).
Il a été montré chez S. carnosus que l’expression de l’opéron nar est influencée par la présence d’oxygène (Pantel et al. 1998). Une diminution de l’oxygène associée à une densité cellulaire qui augmente, induit l’expression de l’opéron nar. La présence de nitrate induit aussi l’expression de cet opéron.
Figure 11. Cartographie de l’opéron nar et environnement génétique chez S. carnosus TM300 et S. xylosus C2a. A) S. carnosus, B) S. xylosus. D’après Fedtke et al. (2002), Vermassen (2014).
1.2) L’activité nitrate réductase
La capacité de réduire le nitrate chez les staphylocoques est assez répandue. Elle est cependant espèce- et souche-dépendante (Miralles et al. 1996, Mauriello et al. 2004, Casaburi et al. 2005, Gøtterup et al. 2007, 2008, Sánchez Mainar and Leroy 2015). Chez S. carnosus, toutes les souches sont capables de réduire le nitrate, la majorité d’entre elles (plus de 60%) montrant une activité nitrate réductase élevée (Sánchez Mainar and Leroy 2015). Ce potentiel est plus variable pour d’autres espèces, en particulier chez S. xylosus où environ 1/3 des souches ont une activité nitrate réductase élevée, 1/3 montre une activité modérée et le tiers restant montre peu ou pas d’activité nitrate réductase (Sánchez Mainar and Leroy 2015). Gøtterup et al.(2007) et (2008) ont caractérisé l’activité nitrate réductase de souches de SCN, dont S. carnosus et S. xylosus, inoculées dans un milieu de laboratoire supplémenté en metmyoglobine et en nitrate ou dans un modèle de saucisson contenant du nitrate, en évaluant leur capacité à former de la nitrosomyoglobine.
L’activité Nar est modulée par plusieurs paramètres comme la présence du cofacteur molybdène (Maia and Moura 2015). Talon et al. (1999) ont montré que la synthèse de la nitrate réductase des souches appartenant à S. carnosus et à S. xylosus est dépendante de l’oxygène. La synthèse de l’enzyme est maximale en début de phase stationnaire en condition aérobie, tandis que celle-ci est maximale durant la phase exponentielle en condition statique. De plus, la synthèse de l’enzyme est fortement augmentée en présence de nitrate, surtout chez S. carnosus (Talon et al. 1999).
Dans une matrice carnée, le nitrate est réduit en nitrite par S. xylosus C2a (Vermassen et al. 2014). Dans cette même étude, l’opéron nar n’est pas diffentiellement exprimé entre la condition avec et sans nitrate après 24h et après 72h d’incubation (Vermassen et al. 2014). Le dosage du nitrate dans la matrice carnée a montré qu’après 24h plus de 80% du nitrate a été consommé, ce qui peut expliquer pourquoi les gènes ne sont pas différentiellement exprimés dans les conditions de l’étude.
2) La nitrite réductase
nitrite réductase Nir de Escherichia coli et les nitrites réductases Yrh et Nas de Bacillus subtilis (Neubauer et al. 1999).
Chez S. carnosus et chez S. xylosus, les gènes sirA, nirB, nirD et sirB constituent l’opéron nitrite réductase (nir) (Neubauer et al. 1999, Vermassen 2014). Une région promotrice a été identifiée en amont de sirA chez S. carnosus (Figure 12) (Neubauer et al. 1999). Les gènes gènes nirB et nirD codent respectivement les protéines NirB et NirD impliquées dans l’activité nitrite réductase. Chez S. carnosus, les protéines NirB et NirD sont essentielles et suffisantes pour la réduction du nitrite de façon NADH dépendante (Neubauer et al. 1999). Les gènes sirA et sirB codent respectivement les protéines SirA et SirB qui sont essentielles à la biosynthèse du groupement prosthétique de type sirohème servant de cofacteur (Spencer et al. 1993, Neubauer et al. 1999). SirA catalyse la méthylation S-adenosyl-methionine-dépendante de l’uroporphyrinogène III en dihydrosirohydrochlorine, tandis que SirB est importante pour la déhydrogénation pyridine-dinucléotide-dépendante de la dihydrosirohydrochlorine en sirohydrochlorine.
Figure 12. Cartographie de l’opéron nir et environnement génétique chez S. carnosus TM300 et S. xylosus C2a. A) S. carnosus, B) S. xylosus. D’après Neubauer et al. (1999), Vermassen (2014).
Chez S. carnosus, deux gènes sont en amont du gène sirA : nirC et nirR tandis que chez S. xylosus le gène nirC est absent (Vermassen 2014). Chez S. carnosus, la protéine NirC possède son propre promoteur et son propre terminateur et ne fait pas partie de l’opéron nir (Neubauer et al. 1999). Le rôle de NirC reste à définir. Le rôle de NirR est également mal défini mais il pourrait avoir un rôle de régulateur ou être impliqué dans l’assemblage du complexe nir (Neubauer et al. 1999).
La réduction du nitrite est régulée à différents niveaux chez S. carnosus (Neubauer et al. 1999). Le premier niveau de régulation se situe au niveau de la transcription. L’oxygène, sous la dépendance de protéines régulatrices, inhibe la transcription de l’opéron nir alors que la présence de nitrite favorise cette transcription. D’autres étapes comme la traduction, le repliement et l’assemblage des protéines du complexe et l’incorporation de groupes prosthétiques sont également sensibles à l’oxygène (Neubauer et al. 1999).
2.2) L’activité nitrite réductase
Différentes espèces de staphylocoques dont S. carnosus et S. xylosus sont capables de réduire le nitrite en ammoniaque (Hartmann et al. 1995). Gøtterup et al. (2007) ont également testé le potentiel nitrite réductase de 4 souches de S. carnosus et d’une souche de S. xylosus. Alors que toutes les souches de S. carnosus présentent une activité nitrite réductase, celle de S. xylosus n’en possède pas (Gøtterup et al. 2007).
La nitrite réductase chez S. carnosus est une enzyme cytosolique impliquée dans la régénération du NADH (Neubauer and Götz 1996). L’activité nitrite réductase a lieu en condition anaérobie et est induite par la présence de nitrate et de nitrite in vitro (Neubauer and Götz 1996).
3) La régulation des opérons nar et nir
Chez S. carnosus TM300, trois gènes situés en aval de l’opéron narGHJI et en amont du gène narT ont été identifiés et désignés nreABC (Figure 11) (Fedtke et al. 2002). Ces gènes sont aussi retrouvés chez S. xylosus C2a et sont organisés de la même façon que chez S. carnosus, à l’exception d’un gène de fonction inconnue situé entre le gène nreC et le gène narT (Vermassen 2014). Chez S. carnosus, le mutant de délétion nre est sévèrement impacté dans sa capacité à réduire le nitrate et le nitrite en aérobiose et anaérobiose du fait de la
Chez S. carnosus, la protéine NreB est le principal senseur d’oxygène. NreB et NreC fonctionnent comme un système senseur-régulateur où, en absence d’oxygène, l’activité d’autophosphorylation de l’histidine kinase cytoplasmique NreB augmente, la protéine NreC est ensuite phosphorylée par NreB et s’accroche spécifiquement aux promoteurs des opérons nar et nir pour augmenter leur transcription (Fedtke et al. 2002, Müllner et al. 2008).
Le rôle de la protéine NreA a été mis en évidence chez S. carnosus (Niemann et al. 2014, Nilkens et al. 2014). Il a été montré qu’en absence de nitrate, NreA interagit directement avec NreB et empêche son activité d’autophosphorylation, conduisant à la diminution de la transcription des gènes des opérons nar et nir. A l’inverse, en présence de nitrate, NreA forme un complexe avec le nitrate et ne peut plus inhiber NreB qui peut alors agir sur elle-même et phosphoryler NreC, ce qui active la transcription des gènes des opérons nar et nir (Nilkens et al. 2014).
En matrice carnée, le gène nreB chez S. xylosus C2a est fortement activé après 24 heures d’incubation (Vermassen et al. 2016a). Par conséquent, les gènes de l’opéron nar, narT et de l’opéron nir sont surexprimés à 24 heures et à 72 heures (Vermassen et al. 2016a).