Chapitre I : Une introduction à la paléogénétique
F. Le laboratoire de haut-confinement
Bénéficier d’un accès à un laboratoire de haut-confinement, dont l’utilisation est restreinte aux biologistes moléculaires formés, est indispensable et un facteur important pour la génération de résultats fiables. Les objectifs d’une telle structure sont doubles :
- Séparer les expériences menées sur des échantillons modernes (que nous définirons
comme postérieurs au 20ème siècle) des expériences effectuées sur des échantillons
anciens.
- Concernant les échantillons anciens : minimiser les risques de contaminations inter- échantillons et utiliser des réactifs et matériels décontaminés de manière appropriée.
Le laboratoire moderne
Comme pour tout laboratoire de biologie moléculaire, les postes de préparation, extraction et purification des acides nucléiques sont séparés du poste de préparation des réactions enzymatiques (PCR, banque de séquençage). Le poste d’analyse post-PCR est situé dans un local indépendant, où les utilisateurs se doivent de porter des sur-chaussures, blouses jetables, gants, et de respecter la règle « Tout ce qui rentre en salle post-PCR n’en ressort plus ». Séparé physiquement du laboratoire moderne, le laboratoire à haut-confinement de l’Institut Jacques Monod été prévu dès les plans initiaux de construction (Figure 3).
Figure 3 : représentation schématique du laboratoire de haut-confinement de l’Institut Jacques Monod.
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La première pièce : le sas
On accède à cette première pièce uniquement en portant des vêtements lavés à l’eau javellisée et strictement dédiés aux expériences de paléogénétique. La pression dans le sas est supérieure à la pression atmosphérique normale. On y entrepose du matériel et des vestiges archéologiques. Les expérimentateurs y enfilent une première combinaison jetable, une première paire de gants, des chaussures javelisables en plastique, des sur-chaussures, un masque et une charlotte. Tout le matériel entrant destiné aux expériences sera abondamment vaporisé de manière homogène à l’eau de javel. Le sas est séparé de la première pièce du laboratoire par une porte qui ne peut être ouverte qu’au moment où la porte d’entrée est fermée.
La seconde pièce : la préparation des échantillons
Les échantillons à analyser seront préparés (découpage des os, pesée des sédiments…) dans cette pièce, avant d’être réduit en poudre par cryobroyage. Une surpression par rapport au sas y est maintenue, pour éviter que des contaminants provenant du sas puissent y pénétrer.
La troisième pièce : l’extraction et la purification de l’ADN
En pénétrant dans cette pièce, une seconde combinaison jetable et une seconde paire de gants doivent être enfilée. Cette pièce, dont la pression est supérieure à la précédente, est munie d’un poste de sécurité microbiologique (PSM). C’est dans cette enceinte que sont fabriqués les tampons nécessaires à l’extraction de l’ADN et pour procéder à la purification des molécules sur des colonnes de silices. Des aliquotes des différents échantillons pourront ensuite être préparés avec l’objectif de les caractériser qualitativement (tests d’inhibition) ou quantitativement (dosage Qbit® ou Nanodrop®).
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La quatrième pièce : la préparation des réactions enzymatiques
Lorsqu’il est nécessaire d’accéder à cette pièce, la combinaison utilisée dans la troisième pièce doit être retirée, et une tenue dédiée doit être enfilée, les gants et sur-chaussures doivent également être changés. Les mélanges réactionnels pour les amplifications par PCR ou pour les banques de séquençage de type shot-gun sont préparés dans cette dernière pièce, dont la pression est la plus élevée.
Mentionnons que les réactifs, qu’ils soient enzymatiques ou chimiques, utilisés dans ce laboratoire confiné proviennent toujours des stocks issus directement du fournisseur. Ils ne sont en aucun cas des aliquotes de solutions déjà utilisées dans le laboratoire moderne. Il est aussi utile de signaler que toutes les expériences sont effectuées dans des enceintes de travail dédiées à une étape expérimentale spécifique, nettoyées à l’eau de javel et irradiées à très courte distance par des rayons UV germicides après manipulation. Les équipements en contact avec les échantillons et les réactifs, comme les tubes de cryobroyeurs et les pipettes, sont décontaminés soit avec l’eau de javel, soit avec du RNase away selon leur sensibilité à la corrosion, et irradiés aux UV.
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III.
Bilan du chapitre I
Au cours des trente dernières années, la paléogénétique a connu un essor rapide et important. Parallèlement à la mise en place de nouvelles technologies de séquençage, présentant des coûts moins élevés, les travaux de recherche se sont multipliés pour tenter de répondre à des questions aussi diverses et variées que la domestication d’animaux tels les chevaux (Ludwig
et al., 2009) ou les bœufs (Geigl, 2011), sur la composition de la biodiversité des
paléoenvironnements (Bellemain et al., 2013), sur l’analyse des régimes alimentaires d’animaux maintenant disparus (Willerslev et al., 2014 ; Wood et al., 2012) ou sur l’évolution des pathogènes dans les sociétés humaines (Yersinia pestis (Bos et al., 2011) ou Mycobacterium
tuberculosis (Harkins et al., 2015)).
Du fait des caractéristiques intrinsèques de l’ADNa, qui est composé de courtes molécules dégradées, modifiées biochimiquement et noyées dans de l’ADN environnemental, les échantillons archéologiques sont sujets à des contaminations, dès le début des fouilles. Pour minimiser celles introduites en laboratoire, il est hautement préférable que les analyses de paléogénétique soient menées par des équipes spécialisées ayant accès à un laboratoire de haut- confinement. C’est ce que nous avons souhaité mettre en œuvre dans le cadre de cette thèse par cette collaboration entre le laboratoire Chrono-environnement et l’Institut Jacques Monod. De plus, les méthodes de biologie moléculaire doivent être adaptées au matériel ancien, ce qui a nécessité l’expertise de l’équipe de « Paléogénome et Épigénome » au sein de laquelle ont été réalisés tous les travaux de cette thèse. Les membres de cette équipe ont partagé avec générosité au cours de ces trois années, leur expérience et compétences en paléogénétique, ainsi que leur temps, ce qui a permis de rendre fructueux ce projet.
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