La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

Mise au point par Mullis et Erlich en 1985, l’amplification par PCR permet d’amplifier in vitro une séquence particulière d’ADN à partir de très faibles quantités de ce dernier. Cette méthode est fondée sur le fonctionnement cyclique d’une ADN polymérase qui copie en grande quantité une séquence spécifique d’ADN. Des amorces oligonucléotidiques de synthèse, de longueur d’environ une vingtaine de nucléotides, s’hybrident à l’extrémité 3’ de part et d’autre de la séquence à copier. Une ADN polymérase thermostable vient alors synthétiser, en présence de

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désoxyribonucléosides triphosphates (dNTPs), un brin complémentaire pour chaque brin d’ADN dans le sens 5’ vers 3’.

La technique de PCR se déroule en trois étapes :

(1) dénaturation : cette étape correspond à la rupture, à haute température, des liaisons hydrogènes qui maintiennent les deux brins complémentaires de la double hélice d’ADN. Cette étape se déroule généralement à 94 °C.

(2) hybridation : en se mettant dans les conditions de renaturation de l’ADN, par diminution progressive de la température, les amorces oligonucléotidiques spécifiques viennent s’hybrider sur leurs séquences complémentaires. Cette étape est cruciale pour la spécificité de la PCR et se déroule entre 40 et 65 °C.

(3) polymérisation : les oligonucléotides hybridés sur la séquence cible servent d’amorce à l’ADN polymérase, qui va recopier, au cours du premier cycle, chacun des deux brins initiaux. À partir de cette amorce des dNTPs présents dans le milieu réactionnel sont ajoutés successivement au brin d’ADN en extension à une température comprise entre 72 et 74 °C.

4.5.2.3. Purification des produits PCR 4.5.2.3.1. Principe

Cette étape permet de purifier les produits de PCR pour effectuer ensuite la réaction de séquençage. Le détail de la procédure est décrit à la Fiche technique 9. Le kit Qiaquick (Qiagen) constitué de micro colonne avec les propriétés spécifiques de liaison d’une membrane de silice était utilisé.

Les tampons livrés avec chaque kit sont optimisés pour obtenir un bon rendement d’ADN et permet d’éliminer les contaminants.

Le produit PCR se fixe sur la membrane de silice en présence d’une forte concentration saline tandis que les contaminants (amorces en excès, nucléotides libres, ADN polymérase) passent au travers de la colonne et sont donc éliminés par les lavages alcooliques. Le produit PCR est ensuite élué avec de l’eau ultra pure.

4.5.2.3.2. Réaction de séquençage

La réaction de séquence consiste en une synthèse in vitro d’ADN avec une incorporation aléatoire de didéoxynucléotides (ddNTP).

La matrice (ici un fragment d’ADN purifié) doit être présente en grande quantité (> 100 millions de copies dans le tube de réaction). Elle est mise en contact avec un mélange réactionnel comprenant une ADN polymérase (Taq polymérase), une amorce s’hybridant en 3’ du fragment à

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séquencer, un tampon et un mélange de dNTPs et ddNTP contenu dans le Big-Dye Terminator. Chaque ddNTP porte un fluorochrome spécifique (Tableau IV.3 ci-dessous).

Tableau IV.3. Fluorochromes spécifiques aux ddNTP Didéoxyribonucléotide triphosphate fluorochrome couleur ddGTP ddTTP* ddATP ddCTP R110 TAMRA R6G ROX Noir Rouge Vert Bleu

Le ratio ddNTP/dNTP est de l’ordre de 1/100. Il existe donc 100 fois plus de chance d’incorporer un dNTP qu’un ddNTP. L’incorporation d’un ddNTP stoppe la réaction d’élongation (formation d’un fragment plus court que le fragment d’origine).

4.5.2.3.3. Purification sur plaque G50

Cette étape a pour but de purifier, par gel filtration, les produits de la réaction de séquençage. Le principe est détaillé sur la Fiche technique 8. La résine Sephadex® G50 utilisée permet de dessaler les échantillons, d’éliminer les nucléotides non incorporés (les ddNTP marqués par un fluorochrome) et l’amorce utilisée pour la PCR de séquence présente en excès. La limite d’exclusion de la résine G50 correspond à un oligonucléotide d’environ 20 bases.

128 4.6. Analyse statistique

Toutes les variables quantitatives sont décrites en médiane et en intervalle interquartile (25ème et 75ème percentiles). Toutes les proportions et les fréquences génotypiques sont exprimées en pourcentages avec un IC 95 %. Nous avons réalisé un contrôle qualité de nos données avant l’analyse statistique. En effet, tous les SNP avec un call rate — ou pourcentage de SNPs analysables par individu — inférieur à 0,95 et tous les SNPs en déviation par rapport à l’équilibre de Hardy–Weinberg ont été éliminés de l’analyse. Les modèles génétiques additifs, dominant et récessif ont été appliqués à l’analyse génétique des données. Pour chaque modèle génétique, les SNPs significatifs en analyse univariée sont intégrés dans un modèle de régression multiple en utilisant la méthode ‘stepwise’. Toutes les variables avec un P < 0,1 étaient intégrées dans le modèle et les variables avec un P < 0,05 étaient retenues dans le modèle. La force de l’association SNPs/CHC ou CP a été évaluée par le calcul des odds ratios ainsi que l’intervalle de confiance à 95 %. Tous les SNPs indépendamment associés à la variable dépendante étaient testés à la recherche d’une interaction épistatique dans un modèle de régression. L’étude des corrélations était réalisée en utilisant le coefficient de corrélation de Spearman. Tous les tests statistiques rapportés sont bilatéraux et les valeurs de P < 0,05 étaient considérées comme statistiquement significatives. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel Golden Helix’ SNP & Variation Suite v7.5.2 (Bozeman, MT, USA) et MedCalc, version 11.4.4 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgique).

129 4.7. RÉSULTATS DES DÉTERMINANTS GÉNÉTIQUES DE LA RÉPARATION D’ADN ET DU MÉTABOLISME DES MONOCARBONES AVEC LE RISQUE DU CARCINOME HÉPATOCELLULAIRE ET DE CANCER DU POUMON

Le modèle génétique sous-jacent l’association entre les SNPs et le risque de CHC n’est pas connu à priori. Cette incertitude nous amène à utiliser une famille de modèles génétiques plausibles — additif, dominant, récessif, etc. —, comme c’est le cas pour de nombreuses pathologies dont les modèles génétiques sous-jacents sont souvent inconnus. Utiliser un modèle génétique unique, notamment en phase exploratoire, peut souffrir d’une perte de puissance lorsque celui-ci n’est pas adapté. C’est donc pour cette raison que nous avons analysé nos résultats suivant trois modèles génétiques différents (additif, dominant et récessif) et avons présenté les résultats du modèle génétique le plus pertinent.

4.7.1. Déterminants génétiques de la réparation d’ADN associés au risque de carcinome