3.4.1 Influência da temperatura no crescimento micelial dos isolados
Discos de micélio de 7 mm das culturas monospóricas dos isolados considerados patogênicos foram transferidos para placas de Petri (80 mm de diâmetro) contendo 20 mL de BDA. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 12 x 3 (Fator F: Isolados de Colletotrichum sp.; Fator C: diferentes temperaturas, totalizando 36 tratamentos, com seis repetições constituídas com uma placa cada. Os níveis dos fatores foram assim compostos:
Fator F:
F1: Isolados de Colletotrichum sp. apresentados na tabela 1. Fator C:
C1: Temperatura de 20 ºC. C2: Temperatura de 25 ºC.
C3: Temperatura de 30 ºC.
Após a repicagem, as placas foram incubadas a 20, 25 e 30ºC, em regime de luz alternada com fotoperíodo de 12 h, durante sete dias, acondicionadas em câmara de crescimento.
A avaliação do crescimento micelial foi realizada a partir do segundo dia de crescimento, a cada 24 h, com a medição do diâmetro das colônias em duas posições ortogonais com o auxilio de paquímetro digital, desde o segundo até o sétimo dia de crescimento das mesmas. Após fez-se o ajuste dos modelos linear, quadrático, exponencial, logístico e beta-binomial. O modelo escolhido, foi aquele com maior R2, menor Quadrado Médio dos Desvios e melhor gráfico de distribuição de resíduos.
3.4.2 Influência do meio de cultura no crescimento micelial e na esporulação dos isolados
O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 4 (Fator F: Isolados de Colletotrichum sp.; Fator C: diferentes meios de cultura, totalizando 16 tratamentos, com seis repetições constituídas por uma placa cada. Os níveis dos fatores foram assim compostos: Fator F: F1: Isolados NC. F2: Isolados AOT. F3: Isolados PLAN. F4: Isolados SM. Fator C:
C1: Meio de cultura BDA. C2: Meio de cultura Mathur.
C3: Meio de cultura V8 (Suco V8-Ágar). C4: Meio de cultura Aveia (Aveia-Ágar).
As fórmulas dos meios de cultura utilizados encontram-se no Anexo 1. Conforme observações anteriores foram selecionados os quatro isolados mencionados anteriormente devido principalmente as diferentes capacidades de esporulação que eles apresentavam nos testes anteriores.
Apartir das culturas monospóricas dos isolados, cultivadas em meio BDA por sete dias a 25±2ºC, foi repicado um disco de 5 mm de diâmetro de micélio do patógeno para o centro das placas de Petri, contendo os diferentes meios de cultura. As placas foram vedadas e mantidas a 25±2ºC, em fotoperíodo de 12 h por sete dias.
A avaliação do crescimento micelial foi realizada diariamente no mesmo horário, durante sete dias consecutivos ou até que o micélio já tivesse tomado por completo a superfície da placa com o meio de cultura. A medição do diâmetro das colônias foi determinada com auxilio de um paquímetro digital, medindo-se a colônia em dois sentidos opostos.
As medidas obtidas na avaliação do crescimento micelial foram utilizadas no cálculo do índice de velocidade de crescimento micelial (IVCM) e na taxa de crescimento micelial, empregando-se a expressão adaptada por Oliveira (1991);
IVCM= Somatório ((D-Da)/N) Sendo:
IVCM= índice de velocidade de crescimento micelial; D= diâmetro médio atual da colônia;
Da= diâmetro médio da colônia do dia anterior; N= número de dias após a inoculação
No sétimo dia de avaliação, além do crescimento micelial, também foi determinada a concentração de esporos em cada uma das placas. Para isso adicionaram-se 5 mL de água destilada autoclavada em cada placa, e procedeu-se à raspagem da superfície das colônias com o auxílio da alça de Drigalski, até que houvesse a liberação dos conídios.
A suspensão obtida foi filtrada em dupla camada de gaze e, em seguida, adicionou-se duas gotas de Tween® e procedeu-se a agitação no agitador magnético. Posteriormente, foi utilizada a câmara de Neubauer para a contagem dos esporos em microscópio óptico. Para cada placa, foi avaliada uma lâmina gerando, assim, um total de quatro lâminas por tipo de meio de cultura.
Os dados obtidos no teste da influência dos diferentes meios de cultura no crescimento micelial e na esporulação dos isolados de Colletotrichum sp. foram submetidos à análise da variância para verificação da significância e, quando os dados eram significativos, foi aplicado o teste de comparação de médias pelo teste de Scott-Knott, a 95% de confiança, com auxilio do programa SISVAR®versão 5.3 (FERREIRA, 2010).
3.4.3 Influência da luminosidade no crescimento micelial dos isolados
Para determinar a influência do regime luminoso no crescimento micelial dos isolados, primeiramente, foram obtidos discos de micélio com um vazador de metal de 5 mm diâmetro, de uma colônia do fungo desenvolvida em meio BDA durante 7 dias, os quais foram depositados no centro de outras placas de Petri de 80 mm contendo BDA.
O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 3 (Fator F: Isolados de Colletotrichum sp.; Fator C: diferentes regimes luminosos, totalizando 12 tratamentos, com seis repetições constituídas por uma placa cada. Os níveis dos fatores foram assim compostos:
Fator F: F1: Isolados AG. F2: Isolados PS. F3: Isolados FW. F4: Isolados SEB. Fator C:
C1: Regime luminoso escuro.
C2: Regime luminoso fotoperíodo alternado (de 12h). C3: Regime luminoso luz contínua
Os isolados mencionados anteriormente foram escolhidos devido à diferença observada na taxa de crescimento micelial existente entre os mesmos na temperatura de 25Cº, segundo o item 4.3.1.
Para o tratamento escuro, as placas foram envoltas com papel alumínio, enquanto que no tratamento fotoperíodo alternado as placas foram dispostas dentro de uma câmara de crescimento, sob temperatura controlada de (25±2°C), onde permaneceram por sete dias em fotoperíodo de 12 horas e no tratamento de luz contínua as placas foram acondicionadas em outra câmara de crescimento, com regime de luz contínua (com temperatura controlada 25±2°C).