L’incorporation de variants d’histones

Les variants d’histones sont des protéines homologues à l’une des cinq histones de canoniques mais possédant des propriétés spécifiques. Leur incorporation au sein de la chromatine est un moyen d’introduire des différences de structure et d’activité au sein de la chromatine, importantes au niveau de domaines spécifiques du génome. Ce rôle structural et fonctionnel de ces variants a fait et fait encore l’objet de nombreuses études.

On peut distinguer des variants ubiquitaires comme des variants spécifiques d’un tissu, en particulier le testicule (Table 4). La majorité de ces variants étant incorporés à la chromatine au cours de la spermatogénèse, leur rôle dans ce processus sera étudié par la suite (paragraphe Résultats B. II. 2.).

Un rapide survol de leurs caractéristiques et leurs fonctions principales dans les cellules somatiques sera présenté ici.

Selon les variants d’histones, leur homologie avec l’histone canonique correspondante est très proche ou au contraire très éloignée. Les variants de l’histone H3 sont par exemple très proches de leur homologue canonique. Nous pouvons notamment prendre l’exemple du variant H3.3, qui chez l’homme, diffère de l’histone canonique H3.1 de seulement 4 acides aminés. Au contraire, les variants de H2A sont extrêmement divergents. Nous pouvons prendre l’exemple du variant macroH2A qui possède à son extrémité C-terminale une extension, appelée « macrodomaine », représentant les deux tiers de la protéine.

L’incorporation de ces variants au sein de nucléosomes, marquant ainsi des régions chromatiniennes, à un impact sur de nombreux événements cellulaires tels que la réplication, la transcription ou la réparation des cassures doubles brins.

3.1. Le maintient de l’intégrité du génome

L’implication de H2A.X dans la réparation des cassures doubles brins est maintenant démontrée. Jouant un rôle critique dans le maintien de la stabilité du génome, le variant H2A.X est logiquement conservé chez tous les eucaryotes supérieurs étudiés et représente même l'unique forme de l'histone H2A chez Saccharomyces cerevisiae (Malik and Henikoff,

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2003). Des travaux ont ainsi montré que des cellules embryonnaires (MEF) dérivées de souris H2A.X-/- présentaient un niveau important d’aberrations chromosomiques induites par un rayonnement ionisant, confirmant l’implication d’H2A.X dans la signalisation et/ou la réparation des cassures doubles brins (Stucki et al., 2005).

Le variant H2A.X serait présent dans tout le génome, à raison de deux molécules H2A.X tous les dix nucléosomes (Pilch et al., 2003). Juste après un dommage à l’ADN, H2A.X serait phosphorylée (γH2A.X) au niveau du site de cassure de l’ADN (Rogakou et al., 1998). Cette phosphorylation permettrait alors le recrutement de facteurs de réparation, ceux-ci formant de larges foyers cytologiquement visibles(Bassing et al., 2002; Celeste et al., 2002).

Il a été récemment montré que H2A.X pouvait subir d’autres modifications post- traductionnelles. Des travaux chez l’homme ont montré qu’elle pouvait également être acétylée sur K5 par l’acétyltransférase Tip60, puis ubiquitinée sur K19 par l’enzyme UBC13 (Ikura et al., 2007). Ces modifications faciliteraient le relargage de H2A.X. Ainsi, H2A.X pourrait jouer deux rôles distincts dans les premiers temps de la réponse aux dommages à l’ADN : la phosphorylation de H2A.X permettrait le recrutement de facteurs de réparation tandis que l’ubiquitination et l’acétylation faciliteraient le relargage de H2A.X au niveau du site de cassure.

3.2. La structuration spécifique des centromères

CENP-A est un variant de H3 impliqué dans la formation du nucléosome au niveau des centromères (Sullivan et al., 1994). Sa synthèse semble couplée avec la réplication des centromères durant les phases S/G2 (Shelby et al., 1997). La présence de ce variant au niveau des centromères est capitale pour le recrutement des composants du kinétochore, nécessaires au bon déroulement de la mitose et donc du cycle cellulaire (Amor et al., 2004).

Ce variant semble indispensable à la survie de la cellule. En effet, après invalidation du gène chez la souris, les souris hétérozygotes sont saines et fertiles tandis que les mutants homozygotes ne survivent que quelques jours après la conception, les cellules montrant de gros problèmes mitotiques (Howman et al., 2000). Inversement, une surexpression de ce variant dans des cellules conduit à la formation de sites ectopique de recrutement des kinétochores et de d’assemblage de faisceaux de microtubules, donnant lieu à une instabilité

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génomique (Heun et al., 2006). Ce phénomène est fréquemment observé dans des cellules cancéreuses (Tomonaga et al., 2005; Tomonaga et al., 2003).

3.3 Le marquage des régions transcriptionnellement actives

Les régions transcriptionnellement actives sont marquées par la présence de 2 variants d’histones, les variants H2A.Bbd et H3.3

Le variant H2A.Bbd a été décrit pour la première fois chez l’homme par Chadwick et Willard (Chadwick and Willard, 2001b) comme exclut du chromosome X inactif, d’où lui vient son nom (H2A-bar body deficient).

Des travaux par FRAP ont montré que le dimère H2B/H2A.Bbd s’échangeait beaucoup plus rapidement que le dimère H2A/H2B au sein du nucléosome, suggérant une conformation beaucoup plus lâche du nucléosome contenant ce variant (Angelov et al., 2004; Gautier et al., 2004). Cette conformation plus lâche serait due au fait que l’octamère contenant H2B.Bbd serait associé à un ADN plus court, de 118 à 130 paires de bases selon les travaux (Bao et al., 2004; Doyen et al., 2006).

Le fait qu’il soit exclut du chromosome X inactif et qu’il colocalise avec les régions riches en histone H4 acétylée suggère son association avec les régions transcriptionnellement actives de l’euchromatine (Chadwick and Willard, 2001b; Gautier et al., 2004). La conformation relâchée du nucléosome contenant H2A.Bbd est très proche de la conformation obtenue chez un nucléosome contenant des histones acétylées, suggérant que l’incorporation de H2A.Bbd serait un mécanisme alternatif à l’acétylation des histones dans les régions transcriptionnellement actives (Eirin-Lopez et al., 2008).

La chaperonne NAP1 serait responsable de l’assemblage et de la dissociation du dimère H2B/H2A.Bbd au sein de la particule nucléosomale, cette réaction étant potentialisée par la présence au sein du nucléosome du variant H3.3 (Okuwaki et al., 2005).

Le variant H3.3 est enrichi dans les régions transcriptionnellement actives du génome (Mito et al., 2005), où il remplace l’histone H3 durant l’élongation de la transcription (Schwartz and Ahmad, 2005). Cette incorporation au sein de la chromatine serait médiée par une chaperonne spécifique, la chaperonne HIRA (Tagami et al., 2004). Ce variant est également marqué par des modifications post-traductionnelles spécifiques des régions transcriptionnellement actives, telle que la diméthylation de H3K56 et H3K79 (Hake et al., 2006).

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3.4. La répression de la transcription

MacroH2A est un variant spécifique des vertébrés dont la particularité réside en sa grande taille, 42kDa, soit trois fois la taille de l’histone canonique H2A (Pehrson and Fried, 1992). Ceci est du à la présence au niveau C-terminal d’un grand domaine d’environ 20 kDa appelé "domaine macro" (macrodomain) ou NHR pour Non Histone Region. Deux isoformes non- alléliques sont retrouvées, H2A1 et H2A2, identiques à 80% (Chadwick and Willard, 2001a; Costanzi and Pehrson, 2001). Le splicing alternatif de l’ARNm issu du gène H2A1 produit deux isoformes protéiques, macroH2A1.1 et macroH2A1.2, exprimées différemment dans les tissus (Pehrson et al., 1997).

Les premiers travaux sur macroH2A ont montré qu’il était impliqué dans la formation et la maintenance du chromosome X inactif chez les mammifères femelles et de l’hétérochromatine constitutive (Costanzi and Pehrson, 1998; Costanzi et al., 2000; Mermoud et al., 1999). Le fait que macroH2A soit exprimé en quantité équivalente chez la femelle et chez le mâle et qu’il ne se localise pas exclusivement sur le Xi (Costanzi and Pehrson, 1998; Mermoud et coll., 1999) indique que la fonction de macroH2A n’est pas restreinte au processus conduisant à l’inactivation du X. De plus macroH2A existe aussi chez les oiseaux qui ont des chromosomes sexuels différents et ne possèdent pas le mécanisme d'inactivation du X (Ellegren, 2002), suggérant que la fonction première de macroH2A n'est pas l'inactivation du X.

Ainsi, macroH2A pourrait être impliqué dans la régulation globale de la transcription. En effet, des travaux ex vivo ont montré que le domaine NHR réprime l’expression des gènes (Perche et al., 2000). D’autres travaux ont permis de montrer in vivo qu’une fois incorporé dans un nucléosome, il empêche les facteurs de transcription et les facteurs de remodelage de venir se fixer. De plus, interagissant avec HDAC1 et HDAC2, il jouerait un rôle dans la formation de l’hétérochromatine par recrutement de HDAC (Chakravarthy et al., 2005).

3.5. Une activation ou une répression de la transcription ?

H2A.Z est l’un des variants les plus étudiés, mais son rôle reste encore extrêmement controversé sur l’activation ou la répression de la transcription.

Des travaux sur colonne hydroxyapatite ont montré que H2A.Z était élué beaucoup plus tardivement que H2A, montrant une stabilité plus élevée du dimère H2A.Z/H2B comparé au

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dimère H2A/H2B. Ces résultats sont réversibles si H2A.Z est acétylé (Thambirajah et al., 2006). L’acétylation de H2A.Z au niveau de sa queue N-terminale pourrait ainsi moduler la conformation du nucléosome au niveau des régions de transcription.

Ces résultats seraient confirmés par la présence au niveau des gènes actifs de H2A.Z acétylé chez la levure (Santisteban et al., 2000) et chez l’homme (Bruce et al., 2005). De plus, H2A.Z est souvent associé aux nucléosomes positionnés au niveau des régions promotrices des gènes (Schones et al., 2008) où il est souvent colocalisé avec H4K16Ac (Shia et al., 2006).

Mais H2A.Z semble aussi impliqué dans la répression de l’expression des gènes. En effet, d’autres travaux ont montré que H2A.Z était présent au niveau des gènes inactifs chez la levure (Guillemette et al., 2005) et qu’il s’associait avec la protéine spécifique de l’hétérochromatine HP1α (Fan et al., 2004). Chez les mammifères, H2A.Z mono-ubiquitiné est retrouvé au niveau du chromosome X inactif (Sarcinella et al., 2007).

Les chaperonnes NAP1 et Chz1 sont les deux protéines liant les dimères H2A.Z/H2B. NAP1 peut lier H2A comme H2A.Z (Park et al., 2005). Chz1 chaperonne uniquement le variant H2A.Z (Luk et al., 2007).