L’holotomographie

L’holotomographie est une technique de microscopie combinant la tomographie et les hologrammes.

A ce jour, seules 2 compagnies, fondées en 2010, développent et commercialisent cette technologie :

Nanolive® et Tomocube®. La technologie de l’holotomographie permet à l'utilisateur d'explorer les

tissus vivants de façon quantitative, dynamique et non-invasive, et de fournir une représentation 3D

directe d’objets transparents épais sans agents de contraste ou de marquage fluorescent, dans le but

de décrire les propriétés et constituants de l’échantillon en se basant sur les indices de réfraction (Kim

et al. 2013a). Le principe de fonctionnement est présenté dans le chapitre 2VI. La résolution latérale

est de l’ordre de 100 nm et la résolution verticale de 200 à 400 nm selon les constructeurs (Ali et al.

2016; Lee et al. 2019). L’épaisseur maximum de l’échantillon doit être inférieure à 80 µm, mais les

conditions optimales d’observation sont atteintes entre 30 et 40 µm. La morphologie réelle de

l’échantillon peut ainsi être observée (Kim et al. 2017). Peu de réglages sont nécessaires pour utiliser

un holotomographe, la mise au point est automatique et la vitesse d’acquisition est relativement

rapide (entre 0,5 et 2,5 images par seconde selon les constructeurs, au minimum, en prenant pour

référence le cas où toutes les options disponibles sont activées). Cependant, en fonction des

technologies, la calibration de la surface de référence par rapport à l’objectif n’est pas toujours

ajustable par l’utilisateur ou peut s’avérer difficile selon les caractéristiques de l’échantillon. En effet,

un échantillon turbide ou dense complique la calibration, car le laser dirigé vers l’échantillon est

absorbé par ce dernier, et l’hologramme ne peut donc pas être constitué. Une quantification des

données, comme l’épaisseur et le volume d’un biofilm, nécessite un traitement en post-production

avec le logiciel constructeur, ou avec des logiciels type Matlab. Le chapitre 4 de cette thèse

développera cet aspect.

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A l’heure actuelle, plusieurs études ont été menées sur des cellules sanguines, afin d’obtenir des

informations sur leurs propriétés morphologiques et biochimiques (Kim et al. 2016a; Yoon et al. 2015),

et également lorsqu’elles sont exposées à des parasites (Kim et al. 2013b). La technologie de

l’holotomographie n’étant commercialisée que depuis récemment, il n’existe que quelques recherches

qui mettent en avant son utilité pour l’observation de bactéries, sous forme planctonique ou de

biofilm, exposées à des NPs.

Par exemple, dans Yang et al. 2013a, l’holotomographie est combinée à la microscopie à fluorescence X

pour effectuer une analyse élémentaire des biofilms de Pseudomonas aeruginosa. La combinaison de

ces techniques permet d’éviter e.g. l’utilisation de sondes fluorescentes, et ainsi d’observer les biofilms

dans leur état naturel.

Dans Sadrearhami et al. 2019, l’holotomographie a été employée pour observer des substrats en verre

recouverts de polydopamine (pDA) (notée 5S en Figure 16, 5S correspondant à l’application de

5 couches de pDA). A la surface de ceux-ci ont été déposés du polyéthylène glycol (PEG) et du

monoxyde d’azote (NO), le but étant de déterminer leurs effets, isolément et conjugués, sur l’inhibition

du développement de biofilms de Pseudomonas aeruginosa, à Gram-négatif. La tomographie permet

de rendre compte que l’effet combiné de la pDA et du NO inhibe l’attachement bactérien de 69 %

(Figure 16).

Figure 16 : Images 2D et 3D par tomographie de substrats de verre recouverts de pDA sur lesquels

ont été appliqué du PEG et/ou du NO avant dépôt de bactéries Pseudomonas aeruginosa. D’après

(Sadrearhami et al. 2019).

Dans Oliver et al. 2018, des NPs d’argent ont été liées à de la catéchine, un antioxydant, à l’aide de

différents types de stabilisants. Le diamètre de ces NPs est compris entre 8 et 40 nm de diamètre,

selon le stabilisant utilisé. Après 60 min d’exposition des biofilms aux NPs à une concentration de

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5 µg.mL

, il s’avère que ce sont les effets combinés des NPs d’argent et de l’oligomère de catéchine

qui causent l’inhibition de la croissance des biofilms de Pseudomonas aeruginosa la plus importante.

En effet, les volumes des biofilms ont été quantifiés à partir de la coloration numérique des images 3D

obtenues et, dans le cas des NPs combinées à l’oligomère de catéchine, dont le diamètre est de 8 nm,

99 % du volume observé est vide (Figure 17).

Figure 17 : Représentations 2D et 3D par tomographie de la structure de biofilms de Pseudomonas

mis en contact avec des NPs d’argent décorées de dérivés de catéchine. a) désigne le biofilm de

Pseudomonas seules et b) c) et d) des biofilms exposés à des dérivés de la catéchine. Plus

précisément d) correspond au biofilm exposé à des NPs d’argent liées à un oligomère de catéchine.

D’après Oliver et al. 2018.

Dans ce chapitre ont été présentées différentes techniques d’observation et de caractérisation des

interactions entre NPs et bactéries à l’état planctonique et à l’état de biofilm. Dans la suite de cette

thèse (Chapitre 3), l’électrophorèse est utilisée comme méthode pour accéder à la mobilité

électrophorétique des NPs et des bactéries en systèmes isolés et mixtes. Ainsi, le modèle physique

analytique d’Ohshima donne accès à la densité de charge volumique des particules et à la longueur de

pénétration hydrodynamique du fluide à travers la couche molle des particules considérées. De plus,

les signatures électrocinétiques sont analysées afin de déterminer l’influence des appendices de

surfaces et du pH sur la nature des interactions entre NPs et bactéries.La morphologie des cellules

bactériennes est investiguée par AFM et la rugosité de leurs surfaces est estimée. Enfin, l’analyse par

holotomographie (Chapitre 4) de la structure de biofilms bactériens générés en présence de NPs est

menée à travers différents proxys caractérisant la structure du biofilm (e.g. épaisseur, profil de densité,

ou l’identification de ‘cheminées’ à l’interface biofilm/solution).

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Chapitre 2 : Matériaux, Matériel et Méthodes