L’empreinte peptidique massique (EPM) par MALDI-TOF

Le principe de cette technique se résume en deux étapes. La première repose sur l’ionisation des peptides de digestion des protéines à étudier (les bandes protéiques à identifier sont prélevées sur un gel d’électrophorèse coloré au bleu de Coomassie ou au nitrate d’argent). Elles sont décolorées et déshydratées. La protéine est ensuite hydrolysée en peptides par la trypsine. Le mélange peptidique obtenu est déposé sur une cible en présence de matrice puis il est analysé par MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) – TOF (Time of Flight). C’est une technique d’ionisation dite douce puisque elle génère des ions moléculaires relativement stables. La deuxième étape consiste en la mesure du temps de vol (de l’ordre des nanosecondes) des ions formés dans un tube de vol dans lequel est réalisé un vide poussé (10^-7 millibare). Cette méthode permet d’analyser une large gamme de masse (0,5 à 300 kDa), l’acquisition des données est rapide.

II.9.1.2. Préparation des bandes

a. Prélèvement des bandes : les bandes d'intérêt sont soigneusement (environnement sans

poussières ni empreintes de doigts) excisées. Avant d’exciser les bandes du gel d’acrylamide, il est nécessaire de bien rincer le gel à l’eau distillée. Les bandes sont excisées à l’aide d’un scalpel stérile (faire l’excision le plus près du spot pour éviter le bruit de fond). Les échantillons sont ensuite placés dans des tubes eppendorf de 0,5 ml. A noter que les excisions

71 ont été réalisées à partir de gels colorés au bleu de Coomassie et au nitrate d’argent, seules les techniques de décoloration diffèrent.

b. Décoloration des bandes : deux types de bandes ont été décolorées à savoir les :

 bandes colorées au bleu de Coomassie R 250 : ajouter 100 μl de tampon de bicarbonate d’ammonium 25 mM, acétonitrile 5 % dans chaque tube eppendorf et laisser incuber pendant 30 minutes. Après cela, le tampon est éliminé pour le changer avec le même tampon à 50 % d’acétonitrile et laisser incuber 30 minutes. Cette étape peut être réalisée encore une deuxième fois jusqu’à décoloration totale.

 bandes colorées au nitrate d’argent : le nitrate d’argent est décoloré par une solution de Potassium Ferricyanid 30 mM, sodium thiosulfate pentahydrate 100 mM. Ce mélange (2 ml) est préparé au dernier moment vu son instabilité à la lumière. Puis 200µl de cette solution ont été ajoutés par tube et laisser à incubation 1 à 2 minutes, jusqu’à disparition de la coloration à l’argent. La solution est éliminée, puis deux bains successifs avec 150 µl d’eau pure ont été réalisés pendant 15 minutes pour stopper la réaction. La décoloration est continuée en utilisant le protocole de la décoloration au bleu de coomassie tel qu’il est afin de compléter la décoloration à l’argent.

c. Déshydratation : les bandes sont ensuite déshydratées dans 200 μl d’acétonitrile 100%

pendant 10 minutes d’incubation. Le surnageant d’acétonitrile est ensuite éliminé et les bandes sont passées au Speed Vac de chez Jouan RC 10.22 pour éliminer le reste d’acétonitrile et compléter le séchage des bandes. Ces dernières sont généralement stoppées à ce stade en les stockant à – 20°C avant de les passer à la spectrométrie de masse.

II.9.1.3. Préparation des protéines pour l’analyse

a. Hydrolyse trypsique de la protéine : la protéine est hydrolysée en peptides avec 150 ng

d’enzyme. La réhydratation est effectuée dans 15 μl de bicarbonate d’ammonium 50mM contenant 10 ng/μl de trypsine Promega (Sequencing Grade Modified Trypsin) et suivie d’une incubation de 5 heures dans une étuve Memmert U26 à 37°C.

b. Extraction des peptides : les peptides sont extraits du gel par 8 μl d’acétonitrile 100%,

puis agiter au vortex, avant de les passer au bain d’ultrasons pendant 2 minutes et enfin une incubation de 15 minutes est effectuée à 37°C.

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c. Préparation de la matrice et du calibrant : une solution de matrice en acide alpha

cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA) est préparée à raison de 5 mg/ml dans un mélange (acétonitrile : eau : acide trifluoroacétique ; 50 : 50 : 0,1). Cette préparation est agitée à l’aide d’un vortex puis centrifugée 2 minutes à 3000g pour éliminer les agrégats non dissous. La matrice est alors prête à être utilisée. Le calibrant ProtéoMix4 (LaserBiolabs) est préparée à raison de 5 μl qsp 50 μl de matrice CHCA.

d. Dépôts sur la cible du MALDI-TOF : Nettoyer (sans frotter) la surface de la plaque à

l’eau puis au savon et la rincer à l’eau MilliQ. Déposer sur la cible MALDI 1 μl d’échantillon préalablement vortexé puis 1 μl de matrice. Laisser sécher le dépôt pour que le mélange peptidique se cristallise dans la matrice. Puis déposer 0,4 μl de calibrant à proximité de chaque échantillon, et enfin la plaque est prête à être introduite dans le MALDI-TOF. Où s’effectue l’irradiation à 337 nm de la matrice co-cristallisée avec le mélange peptidique, en les envoyant au TOF. Ce dernier permet d’analyser les ions produits dans la source MALDI. Une calibration externe est faite en bordure du dépôt avec un calibrant composé d’un mélange de peptides. Puis on réalise une calibration interne avec 3 pics remarquables correspondant à des peptides d’autolyse de la trypsine présents dans le spectre de masse de l’analyte. Il s’agit des pics de m/Z (rapport masse sur charge) = 842,509 ; 1045,564 et 2211,104 avec la trypsine Promega utilisée.

II.9.1.4. Identification des protéines

L’identification se fait par interrogation des bases de données protéiques (ex : ProFound, MS-FIT) à partir des masses des peptides obtenus et sélectionnés et des critères à renseigner : la banque de donnée à interroger, la famille, le genre, l’espèce à partir desquels la protéine est isolée, toutefois la recherche sans renseigner ce critère est plus objective, l’enzyme de digestion, les modifications liées aux traitements de la protéine, la tolérance vis-à-vis des masses des peptides mesurées par rapport aux masses théoriques.

Ces moteurs de recherche comparent le spectre de masse aux spectres de masse virtuels des protéines dont le gène est caractérisé et qui sont rassemblées dans des banques de données spécialisées, dans notre cas la base de données utilisée est SWISS-PROT. Cette comparaison est associée à un score fondé sur le nombre de fragments protéolytiques obtenus dont les masses peuvent correspondre à celles des fragments protéolytiques des banques de données, et par la précision avec laquelle les masses sont déterminées. Les meilleurs scores correspondent aux comparaisons les plus fiables.

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