Analyse protéomique par électrophorèse bidimensionnelle (2DE)

L’électrophorèse a connu son essor suite au développement de la PAGE bidimensionnelle. L’électrophorèse bidimensionnelle (2DE) (O’Farrell, 1975) est actuellement une méthode très résolutive et reproductible depuis la réalisation de nombreuses études sur les méthodes d’extraction et de solubilisation des protéines. La 2D-PAGE repose sur la combinaison de deux électrophorèses sur gel successives, présentant l’avantage d’être des séparations selon deux paramètres indépendants et d’avoir une haute résolution. Ainsi, selon la première dimension, les protéines sont séparées selon leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique. Selon la seconde dimension, elles sont séparées suivant leur masse par PAGE au SDS (SDS-PAGE).

Le pré-requis pour réaliser de bonnes analyses par 2DE reste une préparation optimisée des échantillons ainsi que des différentes solutions utiles à la réalisation des électrophorèses. Ceci permet également de séparer une quantité importante en protéines (2 à 5 mg de protéines), favorisant ainsi l’étude des protéines faiblement représentées, tel que les inhibiteurs de la superfamille des serpines.

Les gels de 2DE permettent de visualiser entre 100 et 3000 spots protéiques selon les échantillons et les méthodes de révélation employées. La reproductibilité technique de séparation des protéines par 2DE est bien maîtrisée, facilitant la localisation précise des spots protéiques.

Une étape essentielle pour réaliser des études différentielles de composition en protéines est l’analyse des images résultantes de la visualisation des protéines sur les gels de

65 2DE. Son but est de quantifier, de manière relative, le niveau d’expression des protéines. Pour cela, l’analyse se décompose généralement en quatre étapes :

 la détection des spots protéiques ;  le matching ;

 la suppression du bruit de fond ;  et la normalisation.

Par la suite, le traitement statistique des données permet de déterminer quelles sont les protéines significativement et différentiellement exprimées entre deux échantillons. Leur identification par spectrométrie de masse permet d’interpréter biologiquement les variations d’expression de protéines observées.

II.7.3.1. Première dimension

La première dimension en 2DE sur gel de polyacrylamide consiste en une focalisation isoélectrique (IEF, isoelectric focusing). Dans la première dimension, les protéines du sérum humain traité sont séparées en fonction de leur point isoélectrique (pI) dans des bandes de gels à gradient de pH immobilisé ou « IPG strips » (immobilized pH gradient strips) établi par des ampholytes. Ainsi, sous l’effet d’un champ électrique constant, les protéines chargées vont migrer dans le gradient de pH du gel d’acrylamide jusqu’au pH égal à leur pI. Leur charge étant nulle à cette valeur de pH, les protéines vont ainsi arrêter leur migration. Les protéines sont donc séparées selon leur point isoélectrique.

La focalisation se fait sur une bandelette en matière plastique sur laquelle a été coulé un gel polyacrylamide à 3 % à gradient de pH immobilisé. Ce gel se présente sous forme déshydraté. L’étape de réhydratation se fait par contact direct avec la solution du sérum humain protéique contenant l’inhibiteur de la SERPINA3. La faible concentration du gel permet l’entrée des protéines notamment les inhibiteurs pendant la réhydratation et évite de séparer les protéines selon leur poids moléculaire durant l’IEF. Les IPG strips commerciaux permettent d’obtenir une meilleure reproductibilité entre IEF. Nous avons optés aux IPG strips commercialisés par Bio-Rad, réputés avec ceux d’Amersham pour leur meilleure résolution (Taylor et Coorssen, 2006). Nous avons privilégiés les IPG strips de 0,5 x 7 cm possédant un gradient (gamme) de pH de 4,0 à 7,0.

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a. Réhydratation

10 µl environ du sérum ont été chargés par bandelette. Les volumes correspondants sont dilués dans un tampon de réhydratation (urée 7 M, thiourée 2 %, CHAPS 2%, DTT 0,2%, ampholytes (pH 4 – 7) 2%, 2.10^-3 % bleu de bromophénol, Pefabloc 5 mM).

Les bandelettes sont placées dans les rigoles de l’IEF-CELL (Bio-Rad) contenant les échantillons puis sont recouvertes d’huile minérale. Les gels sont réhydratés de manière passive (20°C, 0 V) pendant une nuit.

b. Focalisation

Le programme de focalisation est le suivant :  50 V (→ constante) pendant 2 h ;  100 V (→) jusqu’à atteindre 200 V.h ;  500 V (→) pendant 1 h ;

 1000 V (↑ rapide) pendant 2 h ;  10000 V (↑) pendant 6 h ;

 et enfin 10000 V (→) jusqu’à atteindre 40 000 V.h.

A la fin de cette étape, les bandelettes sont stockées à - 20°C jusqu’à leur prochaine utilisation pour la deuxième dimension.

II.7.3.2. Deuxième dimension

Suite à l’IEF, il est possible de séparer les différentes protéines (inhibiteurs de la superfamille des serpines en particulier) selon une seconde dimension par électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide (2D-PAGE).

a. Equilibration

Les bandelettes sont équilibrées dans deux tampons d’équilibration (Giometti et al., 2003) successifs :

 Tampon 1 : urée 6 M, SDS 2%, glycérol 30%, Tris 50 mM, pH 8.8, DTT 1%. Incubation pendant 15 minutes sous agitation ;

67  Tampon 2 : urée 6 M, SDS 2%, glycérol 30%, Tris 50 mM, pH 8.8, iodoacétamide 2,5% et une pincée de bleu de bromophénol. Incubation pendant 20 minutes sous agitation.

Cette phase permet de conférer une charge globale négative aux protéines grâce au SDS afin de les séparer uniquement selon leur poids moléculaire lors de la deuxième dimension. Elle permet également de rompre les ponts disulfures grâce au DTT et d’empêcher leur conformation en alkylant les résidus soufrés par l’iodoacétamide pour aider le transfert des protéines d’un gel à l’autre.

b. SDS/PAGE

Après équilibration, les bandelettes sont déposées au dessus du gel de deuxième dimension (gel à 12%, rapport acrylamide/bisacrylamide : 37,5 / 1). Deux bandelettes sont déposées par gel, une à chaque extrémité. Une solution d’agarose à 0,5 % est déposée pour assurer le contact entre les deux gels et immobiliser la bandelette. Les gels sont placés dans la cuve d’électrophorèse Multi Gels Electrophoresis Units (Bio-Rad). La migration est réalisée par la suite en deux étapes :

 Une première étape de migration se déroule pendant 1 heure sous 40 V à ampérage constant de 15 mA/gel ;

 Puis une deuxième étape d’environ 17 heures à 110 V et 15 mA/gel permet la séparation des protéines.

c. Coloration au nitrate d’argent

Pour mieux détecter l’ensemble des spots protéiques présents dans le gel de 2DE, il est recommandé de le colorer au nitrate d’argent. Pour cela, le protocole de Yan et al. (2000) déjà cité ci-dessus est utilisé. Après trois lavages successifs de 5 minutes dans de l’eau milli-Q, les gels sont finalement scannés si besoin pour l’analyse comparative par analyse d’image.

II.7.3.3. Caractérisation par western blot

Après avoir confirmé la présence des spots protéiques dans le gel de 2DE, l’autre gel est gardé pour la caractérisation (révélation) par western blot détaillée ci-après.

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