L ES BIOREACTEURS

La définition du mot bioréacteur varie selon les auteurs. Pour certains auteurs, ce terme recouvre l’ensemble des moyens de culture d’organismes bactériens ou cellulaires

qu’ils soient in vitro ou in vivo tandis que pour d’autres, ce terme ne concerne que les

systèmes permettant la culture in vitro sous conditions environnementales contrôlées. Nous

accepterons la dernière définition pour les moyens artificiels et nous ferons ainsi un bref tour des différents moyens de cultiver les cellules adhérentes et les tissus en ingénierie tissulaire tout en mettant l’accent sur les bioréacteurs utilisés en ingénierie tissulaire des ligaments et des tendons.

Les bioréacteurs peuvent être regroupés en trois grandes familles : les bioréacteurs statiques, ceux à perfusions et ceux à stimulations mécaniques.

I.2.4.1. Les bioréacteurs statiques

Les bioréacteurs statiques sont les systèmes de culture les plus simples. Ils ont souvent la forme de boîtes ou de puits. Ces bioréacteurs permettent l’adhésion cellulaire sans contrainte mécanique et nécessitent un apport de milieu de culture sans mouvement lequel est à renouveler régulièrement (généralement tous les 3 jours). La température de

l’environnement et les pressions partielles de gaz nécessaires à la culture (O2 et CO2) sont

régulées par un incubateur dans lequel ces systèmes sont mis en culture. Ces bioréacteurs sont utilisés en ingénierie tissulaire pour la prolifération cellulaire et pour tester des facteurs biochimiques.

Figure I.12. Exemples de bioréacteurs utilisés en culture cellulaire A droite des boîtes de culture en couche cellulaire et à gauche un spinner

I.2.4.2. Les bioréacteurs à agitation et à perfusion

Les bioréacteurs statiques posent des problèmes en ingénierie tissulaire de ligaments car ils ne permettent que de réaliser des cultures de cellules en couches minces et non sur des supports tridimensionnels structurés. En effet, dès qu’il existe une structure tridimensionnelle de quelques millimètres d’épaisseur, ces systèmes ne sont plus performants en termes d’apport nutritif. Le milieu de culture est formé en grande partie d’eau, ce qui permet à la plupart des nutriments d’être transportés par le milieu de culture comme le glucose, les acides aminés, etc. En particulier, le dioxygène s’y dissout très mal, et sans écoulement du milieu de culture, l’apport en dioxygène par diffusion n’est pas suffisant [MARTIN et VERMETTE, 2005]. Pour y remédier, il est donc nécessaire de créer un mouvement du milieu de culture en l’agitant comme dans le cas des spinners, ou des bioréacteurs rotatifs ou en ajoutant une perfusion qui permet un écoulement remplaçant le principe d’apport de dioxygène par le sang

comme pour les lits fluidisés [MARTIN et al., 2004; MINUTH et al., 1998; PÖRTNER et al.,

2005; QUESNEY et al., 2003]. Il est à noter que pour des mouvements rapides du milieu de

culture, une sollicitation mécanique par cisaillement apparaît (exemple des chambres de flux). D’autre part, ces systèmes permettent de ne renouveler qu’une partie du milieu de culture à chaque fois et donc d’avoir une culture plus régulière. Le milieu de culture contient des déchets à éliminer, la dégradation de la matrice de support mais également des facteurs de croissance potentiellement sécrétés par les cellules. Renouveler tout le milieu de culture d’un seul coup, permet d’éliminer la plupart des déchets mais aussi des protéines sécrétées par les

cellules et ainsi ralentit potentiellement la construction in vitro. Enfin, ces systèmes peuvent

également servir à la co-culture de cellules sans contact [LICHTENBERG et al., 2005].

I.2.4.3. Les bioréacteurs à stimulations mécaniques

Ces dernières décennies, il a été démontré que les stimulations mécaniques pouvaient orienter les cellules et/ou induire une différenciation cellulaire et stimuler la sécrétion de

protéines [VUNJAK-NOVAKOVIC et al., 2004]. Les effets dépendent de la nature de la sollicitation (cisaillement, traction cyclique, traction-torsion, etc.), de son amplitude et de sa durée. Il est donc nécessaire de concevoir des bioréacteurs spécifiques conformes aux différentes stimulations mécaniques souhaitées. Ces trentes dernières années, de multiples systèmes ont été développés tels que les chambres de flux (cisaillement), des chambres de flux doubles avec traction cyclique, des machines de stretching (traction cyclique), etc.

[BILODEAU, 2004; LANGELIER et al., 1999; LICHTENBERG et al., 2005]. Ces

bioréacteurs doivent tenir compte non seulement de la stimulation mécanique souhaitée, mais également de la forme du tissu final [BILODEAU, 2004]. Les premiers bioréacteurs de ce

type étaient relativement petits et continuaient à être placés dans des incubateurs [GARVIN et

al., 2003; LANGELIER et al., 1999]. Avec l’avancée des recherches, la taille des matrices de

support s’est rapprochée de la taille du tissu à cultiver. Aujourd’hui, certains bioréacteurs intègrent des perfusions avec des dispositifs de régulation de la température, du pH, du

dioxygène, des efforts appliqués, etc. [ALTMAN et al., 2002b; BILODEAU, 2004; KAHN et

al., 2008; THE et al., 2006].

I.2.4.4. Les bioréacteurs pour les ligaments et les tendons

Parmi les bioréacteurs présentés dans les précédents paragraphes, trois types de bioréacteurs sont utilisés actuellement en ingénierie tissulaire des ligaments et tendons : les bioréacteurs statiques, les chambres de flux et les bioréacteurs à stimulation cyclique en traction, parfois en traction-torsion avec ou sans perfusion. Comme nous l’avons précisé précédemment (cf. §I.2.4.1) les boîtes et les puits servent essentiellement à la prolifération cellulaire et à la détermination des concentrations optimales de facteurs biochimiques. Quant aux chambres de flux, elles servent à l’étude à long terme des facteurs biochimiques, comme

le TGF-β ou le FGF, sans stimulation mécanique [BRUNE et al., 2007]. Enfin, les

bioréacteurs à stimulations mécaniques, avec ou sans perfusion, permettent, outre la stimulation mécanique, de stimuler les cellules en culture par des facteurs biochimiques dans le milieu ou sur la matrice de support (Figure I.13.). Parmi, les stimulations mécaniques possibles, deux sont les plus utilisées : la traction cyclique et la traction-torsion cyclique

[ALTMAN et al., 2002b; LANGELIER et al., 1999; WANG et al., 2004; ZHANG et al.,

Figure I.13. Exemples des principaux bioréacteurs à stimulation mécanique pour l’ingénierie tissulaire de ligaments et tendons

A : Bioréacteur de ligament du M.I.T. (3D) ; B : Bioréacteur multifonctionnel Bose (3D); C : Bioréacteur de

stretching (LEMTA, M. Marchal, 1D) ; D : Bioréacteur de traction Flexcell International^ (2D).

Malgré l’essor de la discipline, peu d’entreprises proposent des bioréacteurs de ce

type. Bose^ propose un système à une chambre sous traction simple (ElectroForce^®

BioDynamic Test Instruments, Bose^, MN, USA) comme Flexcell International^pour des

plaques 6 puits (Flexcell^ Tension Plus^TM System, Flexcell International^, NC, USA). Le

système Flexcell n’a pas de perfusion et permet des études sur des membranes, la traction est obtenue par un système de vide alternatif qui étire la membrane de façon cyclique [GARVIN

et al., 2003].

En général, les équipes de recherches développent elles-mêmes leurs bioréacteurs

[LANGELIER et al., 1999; WANG et al., 2004; ZHANG, 2008]. Ainsi, deux équipes dans le

monde ont développé leur bioréacteur de traction-torsion cyclique [ALTMAN et al., 2002b;

THE et al., 2006]. Ces deux bioréacteurs, bien que de forme différente, sont conçus sur le même principe, la traction-torsion cyclique est obtenue à l’aide de deux moteurs l’un pour la

traction et l’autre pour la torsion, qui agit soit via un jeu d’engrenages [ALTMAN et al.,

2002b], soit en prise directe sur chaque chambre [THE et al., 2006]. Une perfusion permet la

circulation du milieu de culture entre des réservoirs dans lesquels le milieu est chauffé et dont le pH et la pression partielle de dioxygène sont régulés, et les chambres de culture dans

A B

lesquelles les cellules sont cultivées sur des matrices de support tridimensionnelles [THE et

al., 2006; VUNJAK-NOVAKOVIC et al., 2004].