C ULTURE CELLULAIRE SOUS SOLLICITATION MECANIQUE CYCLIQUE

Figure II.21. Chambre de culture simplifiée en perspective et en coupe

II.4.3. CULTURE CELLULAIRE SOUS SOLLICITATION MECANIQUE CYCLIQUE

Pour évaluer la culture cellulaire sous sollicitation mécanique cyclique, nous avons choisi une translation de 3mm correspondant à une déformation longitudinale de 10% et d’une torsion de 90° à une fréquence de 1Hz pendant 4h par jour durant 7 jours. La stimulation mécanique n’a pas été imposée en continu pour éviter une possible apoptose des cellules

comme le rapportent certaines études [SKUTEK et al., 2003; ZHANG et al., 2008b]. En effet,

Skutek et al. ont montré qu’après 15min. de stimulation cyclique (5% d’étirement à 1Hz) le

nombre de cellules en apoptose est plus élevé qu’en l’absence de stimulation et qu’après 1h le nombre de cellules en apoptose revenait à un niveau comparable à celui du contrôle. En revanche, d’autres études montrent au contraire que la stimulation mécanique augmente la

prolifération cellulaire [BERRY et al., 2003; YANG et al., 2004].

Malgré cette précaution, les matrices de support présentent une diminution de la population cellulaire à J7 par rapport à J0 (Figure II.18.). Cette diminution de la population cellulaire pourrait provenir d’une période trop courte entre l’ensemencement cellulaire et la mise sous sollicitation mécanique (24h). En effet, pour les études présentant une augmentation de la population cellulaire, et non une diminution, une culture des cellules ensemencées était réalisée entre 36h et 5 jours selon l’étude avant de commencer les sollicitations mécaniques. Or, durant notre étude, les matrices de support étaient stimulées

mécaniquement 24h après ensemencement. Zhang et al. ont observé également une diminution de la population cellulaire dès 3h d’étirement (10% à 1Hz) avec une pré-culture de

24h [ZHANG et al., 2008b]. En tenant compte de ces observations, le nombre de cellules peut

diminuer pour un problème d’apoptose mais aussi du fait d’une mauvaise adhésion cellulaire. Les cellules sont ensemencées sur une membrane faite de fibres d’environ 1µm de diamètre. Il n’est pas impossible que les cellules aient moins de points focaux d’adhésion et de ce fait adhèrent moins bien. Ainsi, lorsqu’elles sont mises sous sollicitations mécaniques, il n’est pas impossible qu’une partie des cellules se détache de la matrice de support en plus de l’augmentation du nombre de cellules en apoptose.

Des études supplémentaires, au cours desquelles les matrices de support ensemencées sont cultivées pendant 3 jours avant d’être stimulées mécaniquement, sont en cours de réalisation pour confirmer cette observation. De plus, une étude utilisant des matrices de support dont la membrane microfibrillaire serait plus dense pourrait peut-être confirmer cette hypothèse. 0 5 10 15 20 25

Contrôle Bioréacteur avec étirement cyclique

groupe Collagène I Collagène III In te n s it é d e f lu o re s c e n c e / a c ti v it é m é ta b o li q u e

Figure II.22. Comparaison des intensités de fluorescences normées des collagènes I et III L’étude des protéines de collagènes I et III montre une nette stimulation de la sécrétion de collagène III sous l’effet des sollicitations mécaniques. Par contre, dans le cas du collagène I, peu de différences sont visibles entre le groupe de contrôle et celui stimulé mécaniquement (Figure II.19.). Toutefois, en tenant compte de la diminution du nombre de cellules pour le groupe stimulé et la prolifération cellulaire pour le groupe de contrôle, la quantité estimée de protéines de collagène I par cellule est supérieure pour le groupe stimulé mécaniquement par rapport au contrôle (Figure II.22.). Ainsi, la stimulation mécanique de traction-torsion cyclique augmente la sécrétion des protéines de collagènes I et III. Cette observation a été

également rapportée lors d’études comparables [ALTMAN et al., 2002a] ou d’études sous

stimulation d’étirement cyclique [KIM et al., 2002; ZHANG et al., 2008a].

Enfin, notre travail montre que le rapport de la quantité de collagène III sur celle de

collagène I a également augmenté passant de 0,71±0,05 pour le groupe de contrôle à

0,91±0,15 pour le groupe stimulé mécaniquement. Le rapport de collagène III/I pour le

groupe de contrôle est toutefois plus élevé en comparaison avec le rapport établi (0,45±0,05)

lors d’une étude réalisée sur support en silicone au laboratoire par Mme Zhang [ZHANG, 2008]. Nous pouvons donc émettre l’hypothèse que la structure fibrillaire de la matrice de support a une influence sur la sécrétion de collagène III. Une étude identique à la nôtre, mais sur un support en film de silicone, permettrait de vérifier notre hypothèse.

Par ailleurs, la valeur du rapport en collagène III/I du groupe de contrôle dans notre

étude est également plus élevée de celle observée par Amiel et al. pour des fibroblastes

ligamentaires du genou chez l’humain (0,55±0,06, [AMIEL et al., 1984]). Ceci montrerait que

nos résultats sont trop élevés et ne permettrait pas l’obtention des caractéristiques du tissu souhaité au niveau de la matrice extracellulaire. Il est difficile de se prononcer sur les causes de tels résultats (matrice de support, conditions de culture…) et de l’effet sur la matrice extracellulaire finale. En effet, actuellement, l’influence de la forme du support sur la différenciation cellulaire est encore assez mal connue et le rapport de collagène III/I des fibroblastes ligamentaires cultivés sans sollicitation mécanique est établi vers 0,55 alors que ce même rapport au niveau de la matrice extracellulaire de ligament n’est que de 0,1. A notre

connaissance, seuls Moreau et al. ont étudié dernièrement [MOREAU et al., 2008] les taux de

collagènes de CSMM, cultivées in vitro, sur une matrice de support fibrillaire [HORAN et al.,

2006]. Ces auteurs ont observé un rapport de collagènes III/I de 0,21±0,07 pour le groupe

statique, résultat plus proche que celui obtenu dans le cas des fibroblastes de peau (0,26±0,15,

[CHEN et al., 2004]). Il est à noter que si la matrice de support est également fibrillaire, la

taille des fibres est différente. En effet, leur matrice de support utilise des fibres de soie

torsadées de 38±5,6µm de diamètre. Ces fibres sont beaucoup plus grosses que les fibres de

collagènes dont le diamètre varie entre quelques dizaines et quelques centaines de nanomètres. Par contre, la matrice de support en fibre de PLCL élaborée au sein de notre laboratoire est plus proche de la structure collagénique de fibres alignées préférentiellement

dans le sens longitudinal et dont le diamètre est de 2,6±0,3µm [VAQUETTE, 2008]. Ces

différences entre un support en silicone et des matrices fibrillaires suggèrent une influence du substrat sur la sécrétion cellulaire, et qu’un substrat de fibres alignées induit un comportement

fibroblastique ligamentaire. Ceci est conforté par les observations d’une étude comparative de

la réponse de CSMM et de fibroblastes de LCA cultivés in vitro sur une matrice fibrillaire de

l’ordre de 10µm de diamètre durant une semaine, menée par Liu et al. [LIU et al., 2008a].

Cette étude portait sur les ARNm de collagène I et III et non sur les protéines, mais elle met en évidence que les CSMM transcrivent plus de collagène III sur un support fibrillaire

(ARNm de collagène III/I = 0,48±0,2) au bout d’une semaine et que les fibroblastes de LCA

transcrivent une proportion proche de ceux rapportés par Amiel et al. (ARNm de collagène

III/I = 0,67±0,16). Ces observations bien qu’encourageantes méritent d’être vérifiées au

niveau de la traduction en protéine, les résultats sur les protéines de collagène I et III de

l’étude rapportée par Liu et al. ne permettant pas de déterminer le rapport relatif de

collagènes. Ainsi, une comparaison du rapport de collagènes obtenu lors de notre étude pour le groupe mécaniquement stimulé au rapport de collagène III/I de fibroblastes ligamentaires sur le même support permettrait de confirmer les hypothèses sur l’influence du support ainsi que de vérifier la validation de la matrice de support développée au sein de notre équipe.

Enfin, nos résultats sont à confirmer à l’aide d’une technique plus précise que la fluorescence en microscopie confocale. Nous n’avons actuellement pas encore réalisé ces tests pour des contraintes techniques. En effet, nous avons rencontré des difficultés à collecter les protéines des cellules par les méthodes habituelles de décollement de cellules et lyse puis centrifugation afin de réaliser des analyses par Westernblot, ELISA, ou RIA. Les cellules ensemencées sur la matrice de support tridimensionnelle sont difficilement récupérées après traitement par de la trypsine. Des analyses quantitatives sur lame après coupe histologique sont en cours de réalisation afin de vérifier les résultats obtenus.