Les Observations
Etape 07 L’étude microscopique
La lecture des lames se fait avec un microscope photonique lié ou non à un ordinateur permettant de visualiser et d’enregistrer l’image observée. Elle se fait d’abord au faible grossissement en utilisant impérativement des objectifs plans pour avoir une bonne vue d’ensemble de la tumeur puis au plus fort grossissement pour mieux analyser les détails cellulaires et nucléaires. Cette lecture permet la rédaction du compte rendu descriptif avec précision du stade et du grade de la maladie.
Technique de l’immunohistochimie (IHC)
Cette étape est réalisée après l’examen d’anatomopathologie. Son but est de diagnostiquer et de déterminer l’origine de la tumeur.
Ainsi, une nouvelle coupe est réalisée à partir des blocs précédents mais à la différence de la coupe précédente on repêche les films des coupes à partir d’un bain marie des lames spéciales : lames silanisées.
Réalisation sur des coupes pour la technique de l’immunohistochimie :
Le microtome est réglé pour obtenir des échantillons d’une épaisseur de 1.5μm. Protocole de l’immunohistochimie
-
Mettre le porte lames dans le xylène pendant 15 minutes (déparaffinage) - Plonger les lames dans l’éthanol pendant 15 minutes (fixation)- Mettre la solution de démasquage (pH6) dans le bain marie à 93°C pendant 10 minutes (Réchauffement).
- Mettre les lames dans la solution de démasquage et la porter au bain marie pendant 40 minutes (cette solution permet la révélation des sites antigéniques masqués par des molécules antagonistes).
- Sortir les lames du bain marie et laisser refroidir à l’aire libre pendant 10 minutes - Mettre à l’eau distillée pendant 10 minutes (lavage)
- Entourer chaque échantillon (coupe de tissu) avec le Dakopen. Le cerclage des coupes au stylo Dakopen a pour but de limiter la diffusion des réactifs, puis mettre quelques gouttes de H2O2 et incuber pendant 5 minutes (H2O2 assure le blocage de la péroxydase et la libération des sites antigéniques)
- Préparer un milieu humide pour les lames et les couvrir par un plateau afin de conférer une incubation au noir
- Rinçage à l’eau distillée pendant 5 minutes - Mettre dans la solution TBS pendant 5 minutes
- Additionner l’anticorps primaire (2 gouttes) et incuber en noir pendant 30 minutes - Rinçage des lames à l’eau distillée pendant 5 minutes
- Mettre le porte lame dans le TBS pendant 5 minutes
- Additionner l’anticorps secondaire (2 gouttes) et incuber dans le noir pendant 30 minutes
- Préparation de la DAB : en mélangeant 20 µl de DAB chromogène et 1 ml de tampon (substrat buffer)
- Rinçage à l’eau distillée
- Mettre au TBS pendant 5 minutes
- Mettre 20μl du DAB et incuber en noir pendant 10 minutes - Rincer à l’eau distillée
- Réaliser une contre coloration à l’hématoxyline pendant 5 minutes pour obtenir des lames prêtes à la lecture au microscope
- Rinçage à l’eau - Séchage à l’aire libre
- Le montage des lames via une solution de montage et des lamelles
-La lecture des lames se fait au microscope optique lié ou non à un ordinateur permettant d’observer et d’interpréter la coupe histologique.
c. Etude analytique
Cystadénome mucineux
Le cystadénome mucineux du pancréas correspond à une tumeur bénigne à risque de dégénérescence maligne comportant une à, au maximum, six formations kystiques de contenu mucineux et de taille supérieure à 2 cm. C'est une tumeur primitive du pancréas assez rare, qui représente 10 % des lésions kystiques pancréatiques et 1 % de la totalité des tumeurs pancréatiques. La tumeur se situe au niveau du pancréas caudal dans 90% des cas. L'âge moyen lors de la découverte est de 50 ans et il existe une très nette prédominance féminine. La taille lésionnelle moyenne au diagnostic est de 10 cm [77].
MACROSCOPIE
La tumeur se présente sous la forme d’une masse sphérique unique, avec une surface lisse et une pseudocapsule fibreuse d’épaisseur variable et des calcifications occasionnelles. Les tumeurs sont uniloculaires ou multiloculaires, avec des kystes de quelques millimètres à plusieurs centimètres de diamètre. Les kystes contiennent soit de la mucine épaisse, soit du matériel nécrotique hémorragique. La surface interne des tumeurs uniloculaires est généralement lisse et glissante, alors que les néoplasmes de haut grade ont souvent des projections papillaires.
En l'absence de formation de fistule, il n'y a pas de communication entre les locules du CM et le système canalaire pancréatique [172].
Figure 25 : Tumeur kystique mucineuse. Aspect kystique, avec mucine scintillante [172]
Figure 26: Tumeur kystique mucineuse avec un carcinome invasif associé (en haut à droite). Notez que la tumeur ne concerne pas le canal pancréatique (flèche) [172]
MICROSCOPIE
L’épithélium qui tapisse la surface interne de la paroi kystique est de type intestinal et peut être aplati ou former des papilles de différentes tailles. Les cellules sont cylindriques, riches en mucus et présentent des atypies architecturales et cyto-nucléaires variables. De façon caractéristique, l’épithélium repose sur un stroma très particulier, de type ovarien, à cellularité élevée. Ce stroma forme typiquement une bande dense de cellules fusiformes en dessous de l’épithélium néoplasique. Des calcifications localisées au niveau de la paroi kystique sont parfois retrouvées [67, 78, 79].
Différents grades de dysplasie sont notés et peuvent coexistes souvent au sein de la même tumeur.
Le cystadénome mucineux est classé en trois catégories : 1) Cystadénome mucineux avec dysplasie de bas grade
2) Cystadénome mucineux avec dysplasie de grade intermédiaire 3) Cystadénome mucineux avec dysplasie de haut grade
Dans le cystadénome mucineux présentant une dysplasie de bas grade, l'épithélium cylindrique ne présente que des atypies architecturales et cytologiques minimales, avec une légère augmentation de la taille des noyaux situés à la base, et les mitoses sont absentes [172].
Le cystadénome mucineux avec dysplasie de grade intermédiaire présentent des atypies architecturales et cytologiques modérées, avec des projections papillaires ou des invaginations ressemblant à des cryptes, une pseudostratification cellulaire causée par l’encombrement des noyaux, et des mitoses occasionnelles [172].
Le cystadénome mucineux avec dysplasie de haut grade se caractérisent par des atypies cytologiques, avec la formation de papilles ramifiées avec bourgeonnements irréguliers, stratification nucléaire avec perte de polarité, et les mitoses sont fréquentes et peuvent être atypiques [172].
Jusqu’à un tiers des CM ont un carcinome invasif associé. La composante invasive peut être focale, de ce fait ces tumeurs nécessitent un examen histologique approfondi, avec un échantillonnage adéquat et une surveillance soigneuse.
La présence d'une réaction desmoplastique stromale peut être utile dans le diagnostic différentiel entre le carcinome invasif et les glandes non néoplasiques piégées [172].
Figure 27: Cystadénome mucineux [172] A : Les kystes ne communiquent pas avec le canal pancréatique (flèche).
B : L'épithélium contenant de la mucine présente une dysplasie de bas grade et un stroma sous-épithélial de type ovarien.
Figure 28: Cystadénome mucineux [172]
La transition brusque d'une dysplasie de bas grade (en bas à gauche) à haut grade (en haut à droite).
IMMUNOHISTOCHIMIE
Les cellules de l’épithélium néoplasique expriment des marqueurs épithéliaux et des mucines. Le stroma de type ovarien exprime le gène alpha de l’actine du muscle lisse, les récepteurs de la progestérone et de l’estrogène [78].
Les cellules épithéliales néoplasiques sont immunoréactives avec les kératines 7, 8, 18 et 19, et avec l’anti-membrane épithéliale (EMA), et l’antigène carcino-embryonaire (ACE), et expriment le marqueur de la mucine de type gastrique MUC5AC et les marqueurs de la mucine de type pancréatique DUPAN-2 et CA19-9 [172]. Les cellules caliciformes expriment le marqueur de la mucine intestinale MUC2, et les cellules neuroendocrines intra-épithéliales expriment la sérotonine suivie du polypeptide pancréatique et de la gastrine de la somatostatine [172].
Avec l'augmentation des atypies épithéliales, la mucine produite passe de sulfatée à sialée ou neutre et une immunoréactivité nucléaire de la protéine p53 se produit. Alors que la plupart des CM non invasifs expriment la protéine SMAD4 (DPC4), mais pas MUC1, les CM contenant un composant d'adénocarcinome canalaire invasif peuvent perdre l'expression de SMAD4 et exprimer MUC1 [172].
Tumeurs intracanalaires papillaires et mucineuses
Les TIPMP correspondent à une prolifération anormale de l’épithélium d’un canal pancréatique sécrétant du mucus. Cette sécrétion est à l’origine des dilatations canalaires. Il s’agit d’une tumeur kystique communiquant avec le système canalaire principal appartenant au groupe des tumeurs mucineuses [80].
L’épithélium néoplasique est généralement papillaire et les degrés de sécrétion de mucine, de dilatation des canaux (formation de kystes) et de dysplasie sont variables. Les TIPMP non invasives sont classées en trois catégories sur la base du degré d'atypie cyto-architecturale: dysplasie de bas grade, dysplasie de grade intermédiaire et dysplasie de haut grade [172].
La présence d'un composant de carcinome invasif conduit à la désignation : TIPMP associé à un carcinome invasif.
Bien que les TIPMP puissent survenir à travers tout le pancréas, la plupart se situent à la tête de la glande. Les TIPMP de type canal principal peuvent être diffuses, couvrant toute la longueur du canal pancréatique [172].
Selon la définition, on observe une multicentricité dans jusqu'à 40% des cas. Certains TIPMP du canal principal limitées à la tête de la glande sont associées à une dilatation obstructive de toute la longueur du canal pancréatique. Bien que tous les canaux dilatés sont impliqués dans le néoplasme, les TIPMP peuvent s'étendre jusqu'à l'ampoule de vater et certains TIPMP s'étendent dans les canaux biliaires communs [172].
MACROSCOPIE
Un examen et un échantillonnage macroscopiques appropriés sont importants: la meilleure méthode pour définir le type d’atteinte canalaire est la bissection de pancréas réséqués le long d’un plan créé en plaçant une sonde dans le canal pancréatique principal.
Les sous-types de TIPMP reconnus par les études d’imagerie, à savoir le canal principal ou secondaire sont également identifiables par examen macroscopique, cependant, de
nombreuses TIPMP impliquent à la fois le canal principal et le canal secondaire, lorsque les
deux sont significativement impliqués, les néoplasmes sont désignés sous le nom de type «combiné» [172].
TIPMP de type canal principal
Dans ce type, le canal pancréatique principal est généralement dilaté de manière diffuse.
Le canal est souvent rempli de mucine et il est tortueux et irrégulier. Les TIPMP du canal
principal apparaissent généralement dans la tête de la glande et progressent le long du canal principal.
Le néoplasme peut même s'étendre aux papilles majeures et / ou mineures, entraînant dans certains cas une extrusion de mucine à partir d'un orifice ampullaire dans le duodénum [172].
La documentation de l'implication du canal pancréatique principal a une signification clinique car ce type est associé à un risque plus élevé de dysplasie de haut grade et de carcinome invasif. Dans les TIPMP de type canal principal, le pancréas non impliqué est souvent pâle et ferme, reflétant les modifications de la pancréatite obstructive chronique étendue [172].
TIPMP de type canal secondaire
Les TIPMP de ce type se rencontrent le plus souvent au niveau du l’uncus du pancréas, et forment des structures multikystiques ressemblant à du raisin. Les canaux kystiques dilatés vont de 1 à 8-10 cm et sont remplis de mucine épaisse. Les parois du kyste sont généralement minces et peuvent avoir un revêtement plat ou papillaire [172].
Les kystes individuels peuvent être séparés par interposition de parenchyme pancréatique normal. Le nombre et la taille des papilles varient d’un cas à l’autre et d’une région à l’autre, mais des papilles bien visibles sont présentes dans la plupart des TIPMP de type canal secondaire réséquées si elles sont examinées avec soin. Le pancréas adjacent est généralement normal dans ce type [172].
TIPMP de type oncocytaire
Les TIPMP de morphologie principalement oncocytaire, également appelés néoplasmes papillaires oncocytaires intra-canalaires, peuvent avoir un aspect macroscopique distinctif. Elles forment généralement de larges excroissances papillaires nodulaires friables bronzées (5-6 cm) dans les plus grands canaux pancréatiques [172].
Carcinome invasif
S'il existe, le carcinome invasif produit un épaississement hétérogène irrégulier et hétérogène des parois du kyste, des foyers fibreux dans les végétations nodulaires papillaires endoluminales ou des masses stromales gélatineuses. Ce dernier aspect est caractéristique du carcinome mucineux. Les petits carcinomes invasifs peuvent être macroscopiquement indétectables et un échantillonnage histologique complet est nécessaire pour exclure
l'invasion. Les TIPMP de grande taille peuvent fistuler dans les organes adjacents et des
papilles néoplasiques peuvent se développer dans ces sites secondaires [172].
Propagation et stadification de la tumeur
Les composants intra-canalaires des TIPMP peuvent s'étendre le long du système
canalaire dans le pancréas adjacent ainsi que dans l'ampoule. De temps en temps, une TIPMP peut être associée à des fistules et les cellules néoplasiques peuvent se répandre le long de ces
traces de fistules. Les TIPMP avec dysplasie de haut grade sont considérés en tant que Tis.
Etant donné que le carcinome invasif peut être petit et occulte, une évaluation minutieuse est nécessaire avant de classer un cas dans la catégorie Tis. Les évolutions défavorables rapportées dans certains cas classés Tis ont été au moins partiellement attribuées à des erreurs d'échantillonnage ou d'évaluation.
Figure 29: TIPMP impliquant le canal pancréatique principal [172]
Figure 31: TIPMP de type canal secondaire. Le canal pancréatique principal n'est pas impliqué [172]
MICROSCOPIE
Les TIPMP sont dépourvues de stroma hyper cellulaire «de type ovarien» qui caractérise les CM. Sur le plan architectural, l'épithélium des TIPMP peut être plat ou former des papilles avec des axes fibrovasculaires. Les papilles peuvent aller d’une simple projection microscopique de l'épithélium néoplasique à des protubérances macroscopiquement visibles en forme de doigt pouvant atteindre plusieurs centimètres. Les papilles peuvent être simples et ressemblant à des villosités, ou complexes et ramifiées. La lésion peut être focale,
multifocale (dans 40% des cas) ou diffuse. En général, les bords des TIPMP ont tendance à
être relativement mal définis, et les TIPMP sont souvent étendues au microscope au-delà de la lésion visible macroscopiquement. La lésion néoplasique de l'épithélium peut s'étendre dans les plus petits canaux pancréatiques, imitant la néoplasie intraépithéliale pancréatique. L'épithélium néoplasique peut montrer une variété de directions de différenciation, sur la base du modèle prédominant de différenciation architecturale et cellulaire, les TIPMP peuvent être subdivisés en quatre types: gastrique, intestinal, pancréatobiliaire et oncocytaire [172].
TIPMP de type gastrique
Le type gastrique se rencontre de manière caractéristique dans les TIPMP des canaux secondaires. L'épithélium qui tapisse les kystes est composé de cellules hautes dotées de noyaux basaux et d'un cytoplasme mucineux pâle abondant, rappelant l'épithélium fovéolaire gastrique. Les parties périphériques de la lésion forment souvent des glandes de type pylorique. Cette dernière constatation peut être prédominante dans certains cas. En général, les TIPMP de type gastrique ne présentent que des dysplasies de grade faible ou intermédiaire. Des cellules caliciformes éparses peuvent être vues [172].
TIPMP de type intestinal
Ce type se caractérise par une atteinte des canaux principaux, la formation de hautes papilles bordées de cellules cylindriques avec des noyaux pseudo stratifiés et un cytoplasme basophile avec une quantité variable de mucine apicale. Certains exemples sont composés principalement de cellules de type gobelet présentant des caractéristiques micropapillaires. Les cellules épithéliales des TIPMP de type intestinal présentent généralement une dysplasie de grade intermédiaire ou dysplasie de haut grade [172].
Figure 32: TIPMP de type intestinal [172]
A : Cellules cylindriques hautes pseudostratifiées tapissent la papille B : Les cellules caliciformes
TIPMP de type pancréatobiliaire
Les TIPMP de type pancréato-biliaire sont moins fréquentes que les autres et sont moins bien caractérisées. Elles impliquent généralement le canal pancréatique principal et forment des papilles minces ramifiées présentant une dysplasie de haut grade. Les cellules néoplasiques sont cubiques, avec des noyaux arrondis et hyperchromatiques, des nucléoles proéminents, un cytoplasme modérément amphophile et ont un aspect moins mucineux [172].
Figure 33: TIPMP de type pancréatobiliaire avec dysplasie de haut grade [172]
TIPMP de type oncocytaire
Les TIPMP de type oncocytaire ont généralement des papilles complexes avec un stroma délicat. Les papilles sont bordées de deux à cinq couches de cellules cubiques cylindriques avec un cytoplasme granulaire éosinophile abondant. Les noyaux sont ronds, gros et assez uniformes et contiennent généralement des nucléoles uniques, proéminents et excentriques. Des cellules caliciformes peuvent être dispersées parmi les cellules
l’épithélium de papilles adjacentes peut fusionner, produisant un aspect solide ponctué de
petits vaisseaux. La nature intracanalaire des TIPMP de type oncocytaire avec des zones
solides étendues peut être difficile à reconnaître. La plupart des TIPMP de type oncocytaire
ont suffisamment d'atypies cytoarchitecturales pour pouvoir être qualifiées de dysplasie de haut grade [172].
IMMUNOHISTOCHIMIE
Immunomarquage différentiel des sous-types histologiques de tumeur intracanalaire papillaire mucineuse du pancréas (TIPMP).
Type
histopathologique
MUC1 MUC2 MUC5AC
MUC6CDX2
Intestinal - ++ + + - ++
Pancréatobiliaire ++ - ++ + -
Gastrique - - ++ - -
Oncocytaire + - + ++ -
Tableau 18: Immunomarquage différentiel des sous-types histologiques de tumeurs intracanalaires papillaires mucineuses du pancréas [172]
- : Pas d'étiquetage + : Peut être positif ++ : Généralement positif
Les marqueurs canalaires notamment les kératines 7, 19, CA19-9, B72.3 et CEA, sont fortement exprimés dans la plupart des TIPMP. L'expression des glycoprotéines des mucines est utile pour distinguer les sous-types morphologiques [Tableau 18].
Les TIPMP de type intestinal marquent systématiquement de manière diffuse et forte les marqueurs de différenciation intestinale MUC2, CDX2, et MUC5AC, mais pas MUC1 ni MUC6. A l'inverse, les TIPMP de type pancréatobiliaire expriment MUC5AC et MUC1, mais pas MUC2 ni CDX2. Les TIPMP de type oncocytaire expriment MUC6 et MUC5AC, et
elles sont négatives pour MUC2 et CDX2. Les TIPMP de type gastrique marquent MUC5AC, et elles sont négatives pour MUC1, MUC2, MUC6 et CDX2 [Tableau 18].
Le récepteur du facteur de croissance épidermique est exprimé assez fréquemment dans les TIPMP, en particulier chez ceux présentant une dysplasie de haut grade. ERBB2 est généralement surexprimé dans les TIPMP [172].
La perte d'expression de CDKN2A augmente de fréquence entre les TIPMP présentant une dysplasie de bas grade et celles présentant une dysplasie de haut grade. Cependant un marquage anormal avec des anticorps anti-p53 a été observé dans une petite fraction des TIPMP présentant une dysplasie de haut grade [172].
L'expression de SMAD4 est préservée dans la plupart des TIPMP, quel que soit le degré de dysplasie, ce qui contraste avec la fréquence élevée de perte d'expression dans les néoplasies intraépithéliales pancréatiques de haut grade et dans les adénocarcinomes canalaires infiltrants [172].