Chapitre 1 : Introduction
1.8 La réparation homologue 17
1.8.1 L’étape présynaptique : de la résection à la formation du filament RAD51 17
1.8.1.1 La résection
Bien que l’information génétique soit stockée et préservée sous la forme d’un ADN double- brin (ADNdb), elle est généralement lue sous forme d’un ADNsb. C’est exactement ce qu’il se passe lors de la RH, où la recherche d’homologie doit être faite grâce à un ADNsb recouvert de la protéine RAD51. Il est important de noter que la formation de l’ADNsb n’est pas la conséquence d’une dégradation aléatoire, mais plutôt de l’action de protéines spécifiques. La résection de la CDB est en fait composée de deux sous-étapes (Figure 1.8).
§ La résection par MRN
La première sous-étape de résection débute par l’action structure-spécifique du complexe MRN (« Mre11-Rad50-Nds1 ») et son partenaire CtIP (« C-terminal binding protein Interacting Protein »). Le complexe MRN possède une fonction exonucléase dont l’action de résection de l’ADNdb se fait dans le sens 3’-5’, dépendamment du manganèse (Mn2+) et de CtIP (si la réaction
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se passe en présence de Magnésium (Mg2+)) [49, 50]. Dans cette étape, quelques bases seulement vont être enlevées (20 chez les mammifères), rendant aussi l’extrémité disponible pour une réparation via le Alt-NHEJ [51, 52] (Figure 1.8).
§ La résection par EXO1 et BLM/DNA2
Dans la seconde sous-étape va avoir lieu une résection extensive où des hélicases et nucléases génèrent de longs ADNsb, préparant ainsi la cellule à la RH [53, 54]. Il existe en fait deux machineries capables d’exercer cette résection dans le sens 5’-3’ pour former un ADNsb 3’ protubérant : EXO1 et le complexe BLM-DNA2 (Figure 1.8).
La résection par la 5’-3’ exonucléase EXO1 (« EXOnuclease 1 ») peut être stimulée par les protéines BLM (« Bloom syndrome, RecQ helicase Like »), MRN, CtIP et RPA [55]. BLM va augmenter l’affinité de EXO1 pour les extrémités d’ADN, indépendamment de sa fonction d’hélicase [55, 56]. Contrairement à BLM, MRN est capable d’augmenter la processivité d’EXO1, suggérant la formation d’un complexe. CtIP est aussi capable d’interagir avec EXO1 et de stimuler son activité [57]. Toutefois, bien que cette stimulation d’EXO1 par MRN et CtIP soit importante, elle n’est pas indispensable à la résection [58]. Finalement, l’activité de EXO1 est dépendante du Mg2+ et est significativement moins active en présence de Mn2+ [59].
La résection de l’ADN par BLM-DNA2 s’éffectue dans le sens 5’-3’. La résection par BLM- DNA2 dépend de l’hélicase BLM, puisqu’aucune autre hélicase de la famille RecQ est présente au début de l’étape d’initiation [55]. Bien que DNA2 soit une nucléase/hélicase, seulement son activité nucléase est nécessaire pour la résection [60]. DNA2 possède plus spécifiquement une activité 3’ et 5’ exo/endonucléase [61]. En fait, l’interaction RPA-DNA2 gouverne cette résection et supprime la résection dans le sens 3’-5’ [62].
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Figure 1.8 : L’étape présynaptique de la réparation homologue
Cette étape constitue l’étape initiale de la recombinaison homologue. Plus de détails sont fournis dans le texte. R51 : RAD51 ; CDB : cassure double-brin. Illustration par Anthony M. Couturier.
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1.8.1.2 Le chargement de RPA
L’ADN 3’ protubérant préalablement formé lors de la résection va être recouvert par l’hétérotrimère RPA (RPA70, RPA32, RPA14) (Figure 1.8). Toutes les fonctions de RPA dépendent de sa liaison à l’ADNsb, qui est spécifique et orientée dans le sens 5’-3’ [63]. La liaison de RPA à l’ADN est impliquée dans plusieurs évènements et va permettre, entre autres, le recrutement d’ATR [64]. RPA est hyperphosphorylée par différentes kinases (ATM, ATR et DNA- PK) suite à un dommage de l’ADN ou un stress réplicatif. Il a été montré que la phosphorylation de RPA32 sur la sérine 33 est spécifique à ATR alors que la phosphorylation des sérines S4 et S8 est plutôt médiée par DNA-PK [65-69]. Cette phosphorylation jouerait un rôle important dans la réparation de l’ADN et notamment les interactions protéines-protéines.
La résection reste à être mieux définie chez l’humain pour comprendre un peu plus le choix de la voie de réparation, mais aussi la régulation de cette étape de résection. Récemment, notre laboratoire en collaboration avec celui de Daniel Durocher a montré que la résection pouvait être régulée par la protéine HELB qui est recrutée au niveau de la cassure en présence de RPA et va inhiber l’extension de la résection [70].
1.8.1.3 La fin de l’étape d’initiation : formation du nucléofilament de RAD51
Après la résection de l’ADN et le chargement de RPA, RAD51 est assemblée sur l’ADNsb préalablement conçu. La recombinase RAD51 est ubiquitaire [71]. Cette protéine d’environ 37 kDa est capable de s’assembler sur l’ADNsb [72]. La fonction majeure de cette protéine est l’appariement de brins homologues et l’échange de brin. Cette activité requiert, dans son plus simple appareil, la formation d’un filament de RAD51 (qui porte le nom de « complexe protéique présynaptique », puisque celui-ci se forme avant l’appariement de l’ADN lors de l’étape « synaptique »). RAD51 possède des motifs Walker A et B permettant sa liaison l’ATP, indispensable pour sa liaison à l’ADN [73]. Bien que ces deux domaines permettent à RAD51 d’exercer sa fonction dans la phase synaptique, ils ont aussi pour rôle d’hydrolyser l’ATP, entrainant la dissociation du nucléofilament [74]. La partie N-terminale de RAD51 lui confère la capacité de liaison à l’ADN simple et double-brin [75]. En solution, RAD51 se retrouve sous sa forme octamérique, mais en présence d’ATP et d’ADNsb, RAD51 va se lier à l’ADN sous sa forme monomérique en raison de 6 monomères par tour d’hélice (ou un monomère pour 3 nucléotides) [76]. Bien que RAD51 soit capable à elle seule de former ce filament, elle est affectée à la fois positivement et négativement par diverses protéines régulatrices (quelques éléments
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