ISOLEMENT DES GENES IMPLIQUES DANS LA VOIE DE BIOSYNTHESE DE LA PATULINE.

La même stratégie générale a été appliquée à tous les gènes isolés et clonés lors de ce travail (Figure 7). Elle repose sur le fait que les champignons possèdent des introns très courts. Cette particularité permet d’utiliser comme matrice de départ l’ADN génomique. Cette stratégie a consisté en premier lieu à isoler par PCR à l’aide d’amorces dégénérées à partir d’ADN génomique, un fragment situé à l’intérieur du gène d’intérêt, puis de remonter de part et d’autre du gène, en utilisant des couples hybrides, amorce spécifique/ amorce dégénérée jusqu’à atteindre les régions avoisinant les codons « start » et « stop ». Les extrémités codantes et non codantes respectives 5’UTR (5’untranslated region) et 3’UTR (3’untranslated region) ont ensuite été isolées de l’ADN complémentaire par la technique de Race-PCR. Les séquences des extrémités non traduites ainsi déterminées, des amorces spécifiques ont ensuite été dessinées dans le but de séquencer entièrement l’ADN complémentaire afin de localiser les introns éventuels.

5.1 Préparation de l’ADN complémentaire (ADNc) : 5.1.1 Extraction des ARNs totaux :

Les ARNs totaux ont été purifiés, à partir de 100 mg de mycélium, ces derniers ont été broyés à l’aide d’un Potter dans 1ml de réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Etats Unis ). Ce produit est un mélange de phénol et d’isothiocyanate de guanidine exploitant la méthode de Chomczynski et Sacchi qui permet de solubiliser les composants cellulaires tout en préservant l’intégrité des ARNs (les acides ribonucléiques) (Chomczynski et Sacchi, 1987). Les ARNs ont été séparés de l’ADN et des protéines par l’addition du chloroforme. La solution a été alors homogénéisée 15 secondes par inversion manuelle puis incubée 2 à 3 mi-

Figure 7 : Stratégie générale employée afin d’isoler, cloner et séquencer les gènes d’intérêt.

nutes à température ambiante. Elle a enfin été centrifugée pendant 15 minutes à 14000 RPM et à 4°C. La phase aqueuse (surnageant) a été récupérée et complétée par 500 µl d’isopropanol de façon à précipiter les ARNs durant 10 minutes à température ambiante. Le culot a été ensuite centrifugé 10 minutes à 14000 RPM et à 4° C. Ce dernier contenant les ARNs a été rincé dans 500 µl d’éthanol à 75% afin d’éliminer l’isopropanol et les excès de sels précipités. Après avoir centrifugé à 14000 RPM pendant 5 minutes, et éliminé le surnageant, les ARNs sont resuspendus directement dans de l’eau autoclavée. Les ARNs sont conservés à -80° C après dosage spectrophotométrique à 260nm et 280 nm.

5.1.2. Transcription inverse (la reverse transcription : RT):

Préalablement à la transcription inverse, les ARNs totaux sont systématiquement traités à la désoxyribonucléase (DNAse) I afin d’éliminer les traces éventuelles d’ADN génomique. Les transcription inverses ont été effectuées à partir de 5 µg d‘ARNs totaux dans un volume total de 9 µl d’eau autoclavée. Les ARNm ont été transcrits en ADN complémentaires (ADNc) grâce à transcriptase inverse RevertAid H minus M-MuLV (FBI Fermentas, Vilnius,

Start Stop

ADN Génomique 1eres étapes

- Amplification d’un fragment conservé à l’aide d‘amorces dégénérées. - Marche sur le gène

Start Stop

AAAAAAAAAAAAA ADN complémentaire

2ieme étape

5’UTR 3’UTR

Obtentions des extrémités par RACE-PCR

3ieme étape

Séquençage du cDNA dans son entier Localisation des introns

Site Polyadénylation Initiation transcription Amorces dégénérés Amorces spécifiques Amorces 5’ GeneRacer Amorces 3’ GeneRacer

oligonucléotide dT : (bys 3’) 5’- CTG TCA ACG ATA CGC TAA CGT AAC GGC ATG ACA GGT GT (13)-3’, amorce la synthèse du premier brin d’ADNc en s’hybridant à la séquence polyadénylée de tous les ARN messagers de la solution d’ARNs. L’hybridation a été réalisée pendant 5 minutes à 37° C. L’ajout d’un inhibiteur des ribonucléases la Rnasine (Promega, Madison, Etats-Unis) est nécessaire. 200 Unités de transcriptase inverse ont été incorporés et l’ADNc a été synthétisé pendant 1 heure à 42° C. L’enzyme a été ensuite détruite par chauffage à 85°C pendant 10 minutes. Le produit de la RT a été ensuite refroidi à 4°C, complété à 60 µl final d’eau autoclavée et conservé à –20°C. La qualité de la transcription inverse et le niveau constitutif d’expression ont été contrôlés et évalués en réalisant une PCR avec des amorces permettant d’amplifier un gène (exprimé de façon constitutive) dit de « ménage », dans notre cas, il s’agit de la β- tubuline. Après alignements des gènes et des séquences codantes de la beta-tubuline de certaines espèces d’ascomycetes (Aspergillus flavus, Emericella nidulans, Penicillium digitatum, Leptosphaeria maculans,

Phaeosphaeria nodorum, Pestalotiopsis microspora), deux amorces ont été dessinées. Ces

amorces TubF (5’ CTC GAG CGT ATG AAC GTC TAC 3’) et TubR (5’ AAA CCC TGG AGG CAG TCG C 3’) sont situées de part et d’autre du deuxième intron du gène de la β- tubuline. La localisation de ces oligonucléotides permet ainsi de s’assurer de l’absence d’ADN génomique dans les préparations d’ADN complémentaire.

5.2 Extraction des ADN Génomiques

Le protocole d’extraction d’ADN est basé sur la méthode publiée par Giradin et al, (Girardin et al, 1993). Trois cent mg de mycélium sont broyés avec l’aide d’un potter. 5 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCL, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA pH8, 1% SDS) sont ajoutés au broyat. Après une incubation d’une heure à 37°C en présence de proteinase K (50 µg/ml), celle-ci est inactivée à 65°C durant 10 minutes. Les ADN sont extraits avec un mélange

phénol-chloroforme (7v/3v) pour précipiter les protéines. Afin d’éliminer toute trace d’ARN, la phase aqueuse est traitée pendant 2 heures à 37°C à la RNAse. Après deux extractions successives au chloroforme, l’ADN génomique est précipité à l’isopropanol. L’ADN génomique ainsi précipité est rincé avec 100 µl d’éthanol à 70% afin d’éliminer les sels et les traces d’isopropanol. Après séchage du culot, celui-ci est resuspendu dans 300 µl d’eau ultra pure.

5.3 Amplification de l’ADN : Polymérase Chain Reaction (PCR) :

Les séquences des amorces spécifiques ou dégénérées, utilisées pour différentes amplifications sont présentées dans chaque partie. Les différentes séquences dégénérées ont été dessinées après alignement de plusieurs séquences protéiques homologues de PKS ou d’ABC transporteurs d’origine fongique. Les séquences de certaines autres amorces ont été extraites de la littérature. Toutes les amorces, sans exception, ont été sélectionnées, après détermination de la température de fusion et après confrontation avec la banque de gène GenBank, de sorte qu’elles n’aient aucune homologie significative non spécifique prévisible. Les caractéristiques des amorces (température de fusion Tm, % de GC) ont été calculées par le logiciel Oligonucléotide calculator disponible sur Internet :

(http://www.pitt.edu/~rsup/OligoCalc.html).

Hormis les quatre lettres (A,G,C,T) symbolisant traditionnellement les quatre bases nucléotidiques, plusieurs autres abréviations ont été utilisées dans la description des amorces dégénérées. Par convention M, R, Y, W, S, K, V, H, D, B, et N représente des mélanges de nucléotidiques. M: A ou C, R: A ou G, Y: C ou T, W: A ou T, S : C ou G, K : G ou T , V: A ou C ou G, H: A ou C ou T, D: A ou G ou T, B: C ou G ou T et N:A ou C ou G ou T.

Enfin une base neutre qui peut s’apparier avec les quatre bases conventionnelles a été incor- porée dans certaines amorces. Cette base, l’inosine est symbolisée par la lettre I.

Toutes les réactions de PCR requises pour ce travail ont été réalisées à l’aide d’un thermo- cycleur GenAmp 2400 (Applied Biosystems, Forster City, USA)

De façon générale, le mélange réactionnel des PCR effectuées était constitué comme suit: 300 ng ADN, 1,5 µl d’une solution 50 mM MgCl2 , 5 µl tampon 10X, 0.3µg de chaque amorce, 10 µmoles de chaque dntp ((déoxynucléotide tri phosphate) (Invitrogen, Carlsbad, Etats-Unis) et 2.5 U de la Taq DNA polymérase (Invitrogen, Carlsbad, Etats-Unis), le tout dans un volume réactionnel de 50 µl. Les conditions de PCR n’ont pas été identiques selon les fragments à amplifier. Le nombre de cycles réactionnels effectués dépend de la matrice de départ. Si les PCR sont réalisées à partir d’ADN génomique, le nombre est fixée à 40 cycles et à 45 cycles pour de l’ADN complémentaire. La durée de l’étape d’élongation a été modifiée selon la taille du fragment à amplifier. De même la température d’hybridation varie en fonction de la température de fusion (Tm) des amorces. Aussi les conditions spécifiques de chaque PCR seront rapportées dans les secteurs matériels et méthodes des différentes parties.

Les produits de PCR sont visualisés par électrophorèse sur gel d’agarose. Selon la taille attendue du fragment amplifié, la concentration des gels a été adaptée: 3 % pour les fragments inférieurs à 0,5 Kb, 1.2 % pour ceux de 0.5 à 3 Kb et les gels à 0.8% pour les fragments de plus de 3 Kb. Les migrations ont été réalisées en tampon TBE (89 mM Tris Base 89 mM Acide Borique, 2 mM EDTA).

5.4 Obtention des extrémités par Race-PCR

Pour amplifier l’extrémité 3’ de l’ADN complémentaire des gènes isolés lors de ce travail, nous avons du recourir à la technique de la Race-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends- Polymerase Chain Reaction) mise au point par Frohman (Frohman et al, 1988). L’amorce Bys 3’ a été synthétisée pour s’hybrider à la séquence polyA commune à tout ARN messager (ARNm) et initier la synthèse de l’ADN complémentaire lors de l’étape de transcription

inverse. Par défaut, cette amorce a été systématiquement employée pour toute transcription inverse effectuée, à la place des simples oligonucléotides (dT)12-19 disponibles dans le commerce. Coté 5’, l’amorce contient une queue flottante sur laquelle viendra s’hybrider une amorce lors de la réaction de PCR qui suit la réaction de transcription inverse

L’amplification des extrémités 5’ des gènes étudiés, a été réalisée à l’aide du kit GeneRacer (Invitrogen, Carlsbad, USA). Ce kit est basé sur la « RNA ligase mediated- RACE) variante de la RACE-PCR qui consiste à liguer un Oligonucléotide ARN sur les ARN messagers préalablement déphosphorylés aux extrémités 5’ pour éliminer les ARN tronqués, puis traités à la pyrophosphatase acide du tabac pour enlever la structure protectrice (coiffe constituée d’une guanosine méthylée, la 7-méthylguanosine (m7-G)) en 5’. Cet oligonucléotide fournira un site d’hybridation pour des amorces, après que les ARN messagers soient transcrits en ADN complémentaires. Le principe des deux approches pour l’obtention des extrémités 5’ et 3’ est schématisé dans la figure 8. Après transcription inverse, les extrémités 5’ sont en effet obtenues par amplification de l’ADNc en utilisant coté 5’,une amorce homologue à l’oligonucléotide ARN ligué précédemment et coté 3’, une amorce 100% spécifique du gène étudiée.