L’objectif premier de ce travail entrepris au cour de cette thèse était d’identifier des gènes intervenant dans la synthèse de la patuline en vue de développer ultérieurement des méthodes de détection des moisissures productrices de patuline contaminant les denrées alimentaires. A ce jour deux espèces posent de réels problèmes en termes économiques et sanitaires, dus à leur capacité à produire la patuline. Le premier, Penicillium expansum constitue le principal responsable de la présence de patuline dans les pommes et autres produits transformés à bases de pommes. Le second, Bysssochlamys nivea contamine fréquemment les ensilages, provoquant des accidents toxicologiques dans les élevages.
Initialement deux espèces modèles, Byssochlamys nivea et P. griseofulvum ont été choisies afin d’isoler des gènes impliqués dans la biosynthèse de cette toxine, P. expansum ayant été volontairement écarté en début d’étude, en raison d’un manque de reproductibilité dans sa capacité à produire de la patuline in vitro. La stratégie a donc consisté à isoler en premier les gènes chez les deux premières espèces avant d’envisager l’obtention des séquences chez P.
expansum.
Ce travail a permis d’isoler 3 gènes, entièrement séquencés et susceptibles d’intervenir dans la voie de biosynthèse chez Byssochlamys nivea et un quatrième chez Penicillium
griseofulvum. Le premier gène isolé chez B. nivea code pour une polycétide synthase, l’acide
6-methylsalicylique synthase intervenant au début de la cascade enzymatique aboutissant à la synthèse de la toxine. Le deuxième gène isolé coderait pour une alcool déshydrogénase impliquée dans la transformation de l’isoepoxydon en phyllostine, deux précurseurs de la patuline. Ce gène est exprimé durant la production de la patuline chez plusieurs espèces productrices dont B. nivea, P. patulum et P. vulpinum. (données non présentées dans cette thèse)
Parallèlement, une cinétique de production de patuline par Byssochlamys nivea sur 80 jours a été réalisée. Par HPLC, des profils métaboliques ont pu être dressés mettant en
évidence la production d’autres métabolites secondaires toxiques comme l’acide byssochlamique ou l’acide mycophénolique. La production d’acide mycophénolique par une espèce du genre Byssochlamys n’ayant jamais été décrite dans la littérature, la confirmation par spectrométrie de masse de l’identité du composé suspect a été réalisée en collaboration avec le CEA (M. Delaforge). Outre ces métabolites, l’acide 6-methylsalicylique, premier précurseur de la patuline et produit direct de la 6-MSAS, a été détecté et identifié pendant les 4 premiers jours de la cinétique. Les ARN totaux ont été extraits à chaque point de la cinétique et l’expression des gènes isolés a été évaluée par RT-PCR. Ces gènes sont fortement exprimés les 4 premiers jours de culture puis le niveau d’expression décroit juqu’au 9ième jours où leurs expressions ne sont plus détectées. La forte homologie avec la 6MSAS de P.
griseofulvum ainsi que la corrélation entre l’expression de ce gène et la présence d’acide 6-
methylsalicylique dans les surnageants de culture permettent raisonnablement d’identifier le 1er gène isolé chez B. nivea comme le gène de la 6MSAS.
Suspectant l’implication de l’acide 6-methylsalicylique synthase (6MSAS), dans la synthèse de l’acide mycophénolique, une étude sur P. brevicompactum, espèce productrice d’acide mycophénolique, mais non de patuline a été menée. L’identification d’un gène très homologue à 6msas (Bnpks) chez cette espèce et la mise en évidence de sa non expression lors de la synthèse d’acide mycophénolique par ce champignon, a conduit à invalider cette hypothèse.
En amont du gène idh, sur le brin complémentaire, un gène codant pour un transporteur actif de la famille des ABC transporteurs, a été localisé, isolé et entièrement séquencé chez B.
nivea et P. griseofulvum ainsi que chez P. expansum. La présence d’un gène codant pour un
n’est pas aberrante L’hypothèse d’une implication de cette pompe à efflux dans l’évacuation de la toxine hors du champignon est émise.
Le séquençage du génome d’Aspergillus clavatus, autre espèce productrice de patuline entrepris par le TIGR «The Institute from Genomic Research » laisse entrevoir une formidable avancé dans l’étude des bases moléculaires de la patuline. Nous avons localisé les gènes 6msas, idh et abc, à l’intérieur d’un cluster. Au sein de ce cluster, plusieurs autres « phases ouvertes de lecture » ont été identifiées, codant respectivement pour des enzymes dont l’implication semble évidente à la vue des connaissances actuelles sur la caractérisation chimique de la voie de biosynthèse. En effet, d’après les travaux effectués il y a deux décennies, portant sur l’élucidation structurale des précurseurs de la patuline, l’implication de ces types d’enzymes est très probable.
Un long travail de création de mutants monogéniques est envisagée afin d’identifier le rôle exact de ces différents gènes et ainsi valider le schéma théorique ébauché lors de ce travail. La priorité sera donnée à l’invalidation du gène de régulation dans un premier temps. D’ores et déjà des premiers mutants sont en cours de caractérisation.
De même afin de bien déterminer les bornes du cluster de la patuline, les différents gènes « périphériques » seront recherchés, isolés et séquencés chez nos espèces modèles.
Applications finalisées
Les travaux relatifs à la patuline ont d’ores et déjà apporté des réponses concrètes à des problèmes industriels. En effet, il était reconnu que les deux principales espèces de
Byssochlamys : B.nivea et B. fulva produisaient de la patuline. Or, une étude réalisée par
l’équipe sur un panel relativement divers de souches de ces espèces d’origine différente, conclut à la non-production de patuline par B. fulva, sur des bases analytiques et génétiques. Cette absence de production serait due à l’absence des deux gènes précédemment cités dans le
génome de cette espèce, si ce n’est à l’absence totale du cluster de gènes. B. fulva fréquemment isolée de fruits ne représenterait donc pas une source de contamination par la patuline, dans les filières de transformation. P. expansum est donc considéré comme la principale, voire l’unique source de contamination des pommes par la patuline.
Il est donc important maintenant que le cluster de la patuline est en voie de caractérisation, d’isoler les gènes orthologues chez cette espèce économiquement importante afin de développer, à terme, des outils de détection permettant une meilleure maîtrise de la contamination des pommes par la patuline.
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