Internalisation et localisation intracellulaire

Les dendrimères PAMAM sont des macromolécules dendritiques les plus utilisées à l’heure actuelle en nano-médecine et en particulier pour la délivrance des médicaments et la transfection, grâce à leur commercialisation à l’échelle industrielle depuis 1992 par la société Dendritech. Inc70. De nombreuses études ont montré que la conjugaison des dendrimères PAMAM à des principes actifs ayant de faibles biodisponibilités permet d’améliorer la solubilité de ces médicaments et la perméabilité de ces derniers au travers des monocouches

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Park C. Im M. S., Lee S., Lim J. and Kim C. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9922.

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Trinchi A. and Muster T. H. Supramolecular chemistry 2007, 19, 431.

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Shi X. Y., Wang S. H., Meshinchi S., Van Antwerp M. E., Bi X. D., Lee Y. H. and Baker J. R. Jr. Small 2007, 1245.

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cellulaires. D’autres publications ont rapporté que la modification de surface des dendrimères peut provoquer des changements significatifs dans leurs propriétés biologiques telles que la cytotoxicité et la capacité à traverser les monocouches cellulaires71,72. Par exemple, le couplage des molécules de fluorescéine isothiocyanate (FITC) au dendrimère PAMAM cationique de 4ème génération G4 à un rapport de 8/1 conduit à une diminution de cytotoxicité du dendrimère et une augmentation significative de sa capacité à traverser les monocouches de cellules Caco-272 (lignée cellulaire dérivée d’un carcinome humain du côlon.). Néanmoins, si les modifications de surface permettent d’améliorer la perméation des dendrimères, il y a en revanche peu de données concernant l’influence précise de ces modifications sur le mécanisme de l’internalisation des dendrimères dans les cellules et sur le trafic intracellulaire. D’Emanuele et coll. se sont particulièrement intéressés à l’internalisation des dendrimères par la voie d’endocytose et ont étudié l’effet de la modification de surface des dendrimères PAMAM par des groupements lauryl et/ou propranolol (un médicament de la famille des

β-bloquants) sur le mécanisme de l’internalisation des dendrimères dans les cellules HT-29 (lignée cellulaire de carcinomes humain du côlon) capables d’effectuer l’endocytose73. Afin d’étudier la vitesse de l’internalisation des dendrimères PAMAM par la cytométrie de flux et de visualiser la localisation subcellulaire de ces derniers, les dendrimères PAMAM ont été couplés à la fluorescéine-isothiocyanate (FITC) à un rapport moyen de 1/1 via les extrémités amines restantes des dendrimères.

D’Emanuele et coll. ont analysé l’effet de la modification de surfaces sur la vitesse de l’internalisation des dendrimères-FITC dans les cellules HT-29 par la cytométrie de flux et ont trouvé que, par rapport à la vitesse de l’internalisation des dendrimères non modifiés, la conjugaison de deux groupements lauryl aux dendrimères augmente la vitesse de

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a) D’Emanuele A., Jevprasesphant R., Penny J. and Attwood D. J. Controlled Release 2004, 95, 447. ; b) Jesvprasesphant R., Penny J., Jalal R., Attwood D., McKeown N. B. and D’Emanuele A. Int. J. Pharm. 2003,

252, 263. c) Jevprasesphant R., Penny J., Attwood D., McKeown N. B. and D’Emanuele A. Pharm. Res. 2003, 20, 1543.

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a) Kitchens K. M., Kolhatkar R. B., Swaan P. W., Eddington N. D. and Ghandehari H. Pharm. Res. 2006,

23, 2818. b) Kolhatkar R. B., Kitchens K. M., Swaan P. W. and Ghandehari H. Bioconjugate Chem. 2007, 18,

2054.

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l’internalisation de manière significative (x 2) tandis que la conjugaison de deux molécules de propranolol aux dendrimères diminue considérablement la vitesse de l’internalisation (/ 2).

L’incubation des dendrimères PAMAM fluorescents avec les cellules HT-29 en présence des marqueurs de différents organites ont permis de mettre en évidence la localisation subcellulaire des dendrimères (cf. Figure 1-18). La clathrine et la caveoline sont des marqueurs de l’endocytose, la transferrine un marqueur de l’endosome et le Lysotracker® un marqueur du lysosome. La colocalisation des dendrimères fluorescents qu’ils soient modifiés ou pas avec la clathrine ou la caveoline a confirmé la présence des dendrimères dans la membrane plasmique et dans le cytoplasme. La colocalisation des dendrimères avec la transferrine a permis de conclure que tous les dendrimères ont été internalisés par l’endocytose. Enfin, la colocalisation des dendrimères avec le Lysotracker® a révélé le trafic des dendrimères vers le lysosome, un organite acide riche en enzymes hydrolytiques. Ces résultats concordent avec une étude précédente réalisée sur les cellules Caco-274. Cependant, des études de colocalisation semi-quantitatives réalisées par D’Emanuele et coll. ont montré une accumulation significativement moins importante dans le lysosome pour les dendrimères couplés aux groupements lauryl ou propranolol que pour les dendrimères non modifiés. Des études plus approfondies de la relation entre la surface des dendrimères et leur accumulation dans le lysosome s’avèrent ainsi importantes lorsque ces derniers sont utilisés pour la délivrance des médicaments via des liaisons sensibles aux hydrolases acides, car une bonne connaissance de cette relation permettrait une libération de médicaments contrôlée.

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Kitchens K. M., Foraker A. B., Kolhatkar R. B., Swaan P. W. and Ghandehari H. Pharm. Res. 2007, 24, 2138.

Figure 1-18 : Localisation intracellulaire des dendrimères PAMAM G3-FITC dans les cellules HT-29, en présence de cavérine-1, clathrine, transferrine ou lysotracker®73

Dans la même idée que D’Emanuele et coll., mais d’une manière différente, Kannan et

coll. ont étudié l’effet des fonctions de surface des dendrimères PAMAM (G4-OH, G4-NH2 et

G4-COOH) sur le processus de l’internalisation de ces dendrimères dans les cellules A549 (lignée cellulaire du cancer du poumon humain) grâce aux dendrimères marqués à la fluorescéine75. Les vitesses de l’internalisation de ces trois types de dendrimères ont été déterminées par la cytométrie de flux et ont montré que l’internalisation se fait très rapidement pour les trois types de dendrimères mais avec en tête le dendrimère cationique. Néanmoins, ces vitesses d’internalisation des dendrimères fluorescents peuvent être réduites considérablement en diminuant la température de l’environnement cellulaire (40 à 50 % de réduction pour les dendrimères chargés et presque 70 % de réduction pour le dendrimère neutre). Ce résultat indique que l’internalisation des dendrimères au travers de la membrane

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cellulaire se fait via un transport actif. Kannan et coll. ont donc cherché à savoir par quelle voie d’endocytose se font ces transports membranaires. En mesurant les variations de l’intensité de fluorescence après avoir bloqué successivement les différentes voies d’entocytose par des inhibiteurs spécifiques, ils ont mis en évidence des mécanismes d’internalisation différents selon les surfaces différentes. Tandis que les dendrimères anioniques sont internalisés en partie par la voie d’endocytose dépendante de la cavéoline, les dendrimères cationiques et neutres passent par d’autres voies indépendantes de la clathrine et de la cavéoline. Contrairement aux résultats de D’Emanuele et coll., Kannan et coll. n’ont pas observé de dendrimères fluorescents cationiques dans les lysosomes des cellules A549 et ils ont attribué cette contradiction à la différence des lignées cellulaires étudiées, ce qui indique que la localisation des dendrimères fluorescents intracellulaire dépend de la lignée cellulaire (cellules HT-29 dans un cas et cellules A549 dans l’autre) et de la durée d’incubation avec ces cellules. Ces études de la relation surface-internalisation des dendrimères fluorescents ont permis de montrer qu’il est possible de moduler la cinétique d’internalisation intracellulaire des dendrimères et de cibler la délivrance des médicaments dans un compartiment subcellulaire spécifique, en modifiant la surface des dendrimères.