Interactomique

Les interactions protéine-protéine (IPP) sont à la base de la plupart, si pas toutes, des fonctions cellulaires. La compréhension des réseaux d'associations stables et transitoires reste un objectif clé, tant pour la biologie des systèmes (où elle peut être combinée avec d’autres données «omiques » pour acquérir une meilleure compréhension des voies et des réseaux fonctionnels), que pour les études biologiques ciblées. Une gamme d'approches est actuellement utilisée pour identifier les interactions protéine-protéine (IPP) à haut débit.

A ^B

Fig.12. Stable isotope labeling pour la spéctrométrie de masse quantitative : A- Les cellules marquées par voie

métabolique par mise en culture en présence du milieu SILAC contenant des isotopes d’acides aminés lourds ou légers. Ces cellules sont lysées et les lysats sont poolés puis digérés par des protéases pour être ensuite analysées en LC-MS/MS B- Les mêmes séquences peptidiques provenant d’échantillons marqués lourds ou légers sont chimiquement identiques. Elles coeluent de la colonne de chromatographie HPLC et entrent en même temps dans le spectromètre de masse. Elles apparaissent en doublet séparé par la différence de masse lors du scan peptidique. La hauteur du pic correspond à son abondance. Extrait de Dephoure 2013.

Celles-ci comprennent la spectrométrie de masse précédée par une purification par affinité (AP-SM), la spectrométrie de masse précédée par cross-linking des complexes protéiniques ou cross-linking MS (XL-MS), spectrométrie de masse basée sur la corrélation de profilage des protéines (PCP-MS), et la stratégie de double hybride de levure.

Cartographie d’interaction des protéines en utilisant l’approche haut-débit de spectrométrie de masse basée sur la purification d’affinité

Les techniques de marquage de proximité, basées sur l'identification des protéines avoisinantes par des enzymes peuvent également être utilisés pour identifier les réseaux de protéines et de sonder des structures complexes145.

À l'heure actuelle, la stratégie la plus populaire pour étudier l’interactome d’une protéine à haut et bas débit est l’AP-MS, dans laquelle une protéine appât endogène ou taguée est extraite à partir du lysat cellulaire en utilisant une résine d'affinité. Les protéines associées seront ensuite identifiées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse tandem (LC-MS / (LC-MS). Deux récentes études à grande échelle concernant l’interactome humain mettant en œuvre l’AP-MS ont été réalisées. La première a pu identifier plus de 23,744 interactions impliquant 7,668 protéines. Pour se faire, ils ont inséré 600 protéines taguées par le flag HA dans les cellules HEK 293T. Les protéines co-précipitées avec les protéines taguées ont été identifiées en PA-MS et les résultats sont déposés sur une plate-forme146.

Une deuxième étude réalisée par HEIN et ses collègues a montré l’importance de la force d’interaction et de l’abondance des protéines interagissant dans l’étude de l’interactome147. Ils ont en effet incorporé 1.125 protéines taguées avec la GFP d’une manière stable sur leurs extrémités C et N terminales. 28,500 interactions mettant en jeu 5,400 protéines ont été identifiées. Grâce à l’approche spectrométrique de masse quantitative AP-MS, trois paramètres ont été étudiés : la spécificité d’interaction, la stoechiométrie des interactions et l’abondance des protéines impliquées dans ces interactions. Ces paramètres ont montré que les réseaux des protéines cellulaires sont dominés par des interactions faibles et astoechiométiques et qui jouent un rôle primordial dans la définition de topologie de ces réseaux. La base de données IntAct fournie à partir de ces résultats se trouve sur

http://www.ebi.ac.uk/intact.

Ces deux études ont démontré un chevauchement important avec la base de données référentielle CORUM (Ressource complète des complexes de protéines de mammifères) qui

englobe 2.800 complexes de protéines vérifiés expérimentalement avec haute confiance et qui n’accepte le dépôt d’aucune donnée de travail à haut-débit148.

Stratégies de marquage basées sur la proximité des protéines

Bien que l'AP-MS reste la technique la plus couramment utilisée pour étudier la cartographie des interactions interprotéiques, elle présente néanmoins l’inconvénient de devoir lyser les cellules pour extraire les complexes qui seront destinés aux études en spectrométrie de masse. Cette approche peut briser les interactions faibles ou transitoires entre les protéines. Le développement d’une approche qui tague les protéines qui forment un complexe entre elles devient une nécessité pour maintenir l’intégrité du complexe. Les tests de marquage basés sur la proximité des protéines permettent de marquer d’une manière covalente in vivo les protéines d’un complexe en utilisant des enzymes biotinylantes à espace restreint ou limitées dans l’espace. Ensuite les protéines biotinylées seront extraites du lysat par affinité avec la streptavidine pour être analysées en spectrométrie de masse.

Deux techniques de marquage de proximité sont utilisées récemment pour l'analyse des complexes multiprotéiques et pour l'identification des composants protéiques des compartiments cellulaires spécifiques : La BioID et l’APEX. BioID implique l'expression de la protéine d'intérêt fusionnée à la biotine ligase. En effet, la biotinylation se fait sur des groupes amines sur les protéines voisines lorsqu’un excès de biotine est ajouté aux cellules. Tandis que le type sauvage de la biotine ligase BirA est capable de transférer la biotine seulement sur un substrat spécifique, le mutant BirA (Arg118Gly mutant) permet la biotinylation de toutes les protéines qui se trouvent à 10 nm de proximité149,150. Comme avec AP-MS, l'identification d'une association protéine-protéine en utilisant BioID ne signifie pas une interaction physique directe.

APEX est un rapporteur d’une peroxydase monomèrique dérivée de l’ascorbate peroxydase de pois ou de soja151,152. APEX catalyse l'oxydation de la biotine-phénol en biotine phénoxyle en présence de H2O2, ayant pour résultat la biotinylation de protéines se trouvant à proximité de rayon <20 nm. Alors que la biotinylation des BirA est limitée aux résidus Lys, la biotinylation d’APEX se fait de manière covalente avec des acides aminés riches en électrons, tels que Tyr, Trp, His et Cys. APEX présente aussi un autre avantage dans la confirmation de la localisation des protéines d’un complexe. Il peut induire la précipitation du diaminobenzidine après la fixation en OsO4, ce qui génère un contraste détecté par microscopie électronique. La mutation Ala134Pro d’APEX augmente l’efficacité de biotinylation. Comme dans la BioID, les protéines biotinylées sont purifiées grâce à la sptreptavidine pour réaliser l’analyse en spectrométrie de masse.

Cartograpghie d’interactions des protéines à large débit basée sur des approches alternatives

D’autres bases de données d’interactome sont construites à grande échelle grâce à la spectrométrie de masse précédée par un cross-linking ou XL-MS, ce qui fournit des informations supplémentaires sur la structure topographique des complexes de protéines. Bien que beaucoup des progrès importants aient été faits y compris le développement de cross-linkers clivables en MS, la sensibilité pourrait-être améliorée par l'ajout d’une étape de pré-fractionnement qui permettent d’isoler par affinité spécifiquement les complexes cross-linkés tagués153.

De même, les études de spectrométrie de masse basée sur la corrélation de profilage des protéines (PCP-MS) continuent également à augmenter en couverture et en spécificité. Cette approche se base sur la comparaison des résultats obtenus à interactome de référence154. Cette approche évite les étapes de purification d'affinité et sépare les complexes de protéines en utilisant une variété d'approches qui incluent la densité et l'exclusion de taille, exclusion d'ions et la chromatographie d'interaction hydrophobe.

Catographie haut-débit d’interaction binaire des protéines

Bien que XL-MS n'identifie pas précisément les interactions directes entre les protéines, les autres approches décrites ci-dessus (AP-MS, le marquage de proximité et la PCP-MS) peuvent confirmer la présence des protéines dans un même complexe multiprotéique. Une technique complémentaire qui a été utilisée pendant plus de 20 ans pour détecter les interactions interprotéiques directes est celle de double hybride. Dans cette approche, l'appât et la protéine-proie sont marquées, l’une ou l’autre est liée à l'ADN et l’autre est liée à un facteur de transcription. La liaison entre les deux induit la transcription d'un gène rapporteur. Bien que limitée par les défis techniques et biologiques qui incluent la nécessité de construire de grandes bibliothèques et les taux élevés de faux-négatifs et faux-positifs qui découlent de l'absence de certaines modifications post-traductionnelles dans la levure qui régissent les associations protéine-protéine dans les cellules de mammifères, la stratégie double hybride reste une approche puissante pour détecter ou confirmer (ou les deux) les interactions binaires.

Chapritre III : Les tyrosines kinases et les tyrosines phosphatases