La recherche de partenaires moléculaires des protéines codées par GALIG est une des étapes importantes permettant de comprendre et de caractériser plus finement son mécanisme d’action. Une approche par la technique du double hybride chez la levure (Yeast Two Hybrid System) a tout d’abord été tentée. Malheureusement, très peu de protéines se sont avérées interagir avec les produits du gène GALIG : aucune avec la Mitogaligine, et une quinzaine pour la Cytogaligine. A noter que plusieurs de ces protéines ont un rôle dans le système ubiquitine protéasome. Aucune des protéines n’était mitochondriale, ceci est sans doute dû au fait que le système double-hybride classique dans la levure n’est pas adapté à la détection des interactions entre protéines membranaires et en particulier aux protéines insérées dans les membranes mitochondriales. En effet le système double hybride de levure, nécessite que la protéine appât puisse être transloquée dans le noyau
La seconde approche, via la technique de test d’interaction Luc-PCA (Luciferase protein complementation assay), (Remy et Michnick 2006) nous a permis de mettre en évidence plusieurs partenaires possibles (Figure 18). Ce système repose sur la reconstitution de l’activité luciférase par 2 sous-unités de Gaussia luciférase humanisée (hGLuc1 et hGLuc2), fusionnées aux 2 protéines à tester. S’il y a interaction entre les protéines testées (dans l’exemple, A et C), les 2 sous-unités luciférase sont suffisamment proches pour reconstituer une activité enzymatique et l’ajout de coelentérazine, substrat de l’enzyme, va conduire à une émission de lumière détectable à 480 nm (Figure 18). Par contre, si les 2 protéines testées (dans l’exemple, A et B) n’interagissent pas, l’activité
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luciférase n’est pas reconstituée : aucune émission de lumière ne sera détectée après l’ajout du substrat.
Figure 18 : Technique Luc-PCA (Luciferase protein complementation assay)
Les sous-unités de la luciférase hGLuc1 et hGLuc2, sont fusionnées aux protéines d’intérêts A, B ou C. En absence d’interaction, à gauche lorsque l’on rajoute le substrat de la luciférase, aucune émission lumineuse n’est détectée. En cas d’interaction, à droite, les protéines se rapprochent, ce qui permet aux 2 sous-unités de la luciférase de reconstituer une activité enzymatique. Lorsque le substrat est ajouté, il est métabolisé par la luciférase ce qui conduit à une émission de lumière à 480 nm (Remy et Michnick 2006).
Les premières expériences qui ont permis de valider que ce test pouvait s’appliquer aux protéines mitochondriales ont été effectuées via l’étude de protéines connues pour interagir entre elles et impliquées notamment dans l’apoptose comme Bax, Bak ou encore Mcl-1.
La Cytogaligine peut former un homodimère avec elle-même ou un héterodimère avec la Mitogaligine. Néanmoins, l’étude des Galigines s’avère complexe. En effet, la Mitogaligine semble instable, puisque très vite dégradée au sein de la cellule. C’est pourquoi la plupart des tests d’interaction la concernant nécessitent l’ajout d’un inhibiteur du protéasome, le MG132, qui va permettre sa stabilisation dans le cytosol (Robinet 2010).
Bien que Bcl-XL et Mcl-1 inhibent la mort induite par les produits du gène GALIG (Duneau et al. 2005; Mollet et al. 2013), aucune interaction entre la Cytogaligine et les protéines impliquées dans l’apoptose Bax, Bad, Bcl-2, Bcl-XL et Mcl-1 n’a été mise en évidence.
Il a été montré que la Cytogaligine pouvait interagir avec les domaines « Leucine-zipper » présents notamment dans les facteurs de transcription. Parmi les protéines mitochondriales à « leucine-zipper », nous avons pu mettre en évidence une interaction
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avec LETM1 (Leucine zipper-EF-hand-containing transmembrane protein 1). LETM1 a été identifiée comme étant un transporteur calcique mitochondrial (Jiang, Zhao, et Clapham 2009). LETM1 et la Cytogaligine interagissent avec THEM4 (THEM4, Thioesterase Superfamily Member 4 ou CTMP, Carboxyl-Terminal Modulator Protein). LETM1/THEM4 forme un complexe mitochondrial, qui intervient dans la fission mitochondriale médiée par Opa1 (optic atrophy type-1) (Piao et al. 2009). Or, Mcl-1 qui inhibe la mort induite par les produits du gène GALIG, même si elle n’interagit pas directement avec les Galigines, interagit avec le complexe THEM4/LETM1. Ces deux interactions Cytogaligine/LETM1 et Mcl-1/LETM1 pourraient expliquer les oppositions fonctionnelles mort/survie entre les produits du gène GALIG et la protéine Mcl-1 (Figure 19). De plus, la Cytogaligine interagit également avec la protéine suppresseur de tumeur p53. La protéine p53 est impliquée dans les mécanismes de réparation de l’ADN, en activant la transcription de gènes au niveau du cycle cellulaire. Si la réparation est impossible, l’apoptose est déclenchée. Par ailleurs, des expériences de co-transfection ont montré que l’expression du gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur de GALIG, était diminuée en présence de p53 (Raimond et al. 1995). Cette interaction p53/Cytogaligine pourrait inhiber la fonction de facteur de transcription de p53 et notamment exercer un rétrocontrôle positif sur le gène GALIG.
Des interactions entre les Galigines et l’α-synucléine, protéine impliquée dans les corps de Lewy, caractéristiques de la maladie de Parkinson, ont également été mises en évidence. Cette protéine qui peut être à la fois cytosolique et mitochondriale, induit une cytotoxicité lorsqu’elle s’agrège. Cet aspect est l’un des objets de la thèse de Saïd El Haddad, ayant pour thématique l’expression du gène GALIG dans la maladie de Parkinson. Des études ont montré une dérégulation de l’autophagie chez les patients et les modèles d’études de la maladie de Parkinson (Lynch-Day et al. 2012), c’est pourquoi nous avons recherché des partenaires moléculaires des protéines du gène GALIG impliqués dans ces processus cellulaires.
La Cytogaligine interagit avec les protéines GABARAP, LC3B et la protéine adaptatrice p62/SQSTM1 qui sont impliquées dans les étapes précoces de la formation de la vésicule de macro-autophagie (cf. 1re partie III.B.2.c, p. 32). De plus, la Cytogaligine interagit avec les protéines Hsc70 impliquées dans l’autophagie médiée par les
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chaperonnes. Elle interagit également avec les protéines HUWE1 et UBQLN4 (Ubiquilin-4) qui interviennent dans le Système Ubiquitine Protéasome (cf. 1re partie III.B.1, p. 25), ces deux dernières interactions ayant également été mises en évidence par le système double hybride. La protéine HUWE1, une ubiquitine E3 ligase, qui possède également un domaine BH3, qui lui permet d’interagir avec Mcl-1 (Zhong et al. 2005), mais pas avec les autres membres de la famille Bcl-2. Cette interaction engendre l’ubiquitination de Mcl-1 et donc sa dégradation par le protéasome. On peut envisager que cela pourrait induire une dérégulation de la balance apoptotique, par l’élimination d’une protéine qui protège la membrane mitochondriale, et qui inhibe la mort induite par les produits du gène GALIG.
Figure 19 : Interactome de la Cytogaligine
La Cytogaligine interagit avec les protéines p53 et LETM1/THEM4 impliquées dans l’apoptose, Mcl-1 qui s’oppose fonctionnellement à GALIG, interagit avec le complexe THEM4/LETM1. La Cytogaligine interagit avec HUWE1 et UBQLN4 impliquées dans le système ubiquitine protéasome. Elle interagit aussi avec Hsc70 impliquée dans l’autophagie médiée par les chaperonnes. Elle interagit également avec les protéines LC3B, GABARAP et p62 impliquées dans la formation de la vésicule d’autophagie.
En conclusion, la Cytogaligine interagit avec plusieurs partenaires impliqués dans l’autophagie et le Système Ubiquitine Protéasome (Figure 19).
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Ces données récentes permettent pour la première fois de fournir des pistes quant au mécanisme d’action des produits du gène GALIG. Deux questions sont aujourd’hui posées :
Existe-t-il d’autres protéines, impliquées dans l’autophagie et UPS, capables d’interagir avec la Mitogaligine et la Cytogaligine ?
Quel est le rôle, s’il y en a un, des Galigines dans l’exécution de ces deux processus de recyclage ?
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