La purification des cellules mononucléées du sang et de la moelle osseuse, la différenciation en monocytes/macrophages des cellules de patients atteints de LAM, la lyse et l’extraction des ARN totaux sont les mêmes que celles utilisées pour la différenciation des lignées cellulaires décrites article 1. La technique de dosage par ddPCR des différents gènes étudiés pour les cellules issues de patients atteints de LAM est la même que celle utilisée pour l’étude des patients atteints du VIH article 2.
III. Résultats : A. Groupe M0-M4 :
1) Expression du gène GALIG et des gènes impliqués dans l’autophagie : a) Au niveau de la moelle osseuse
Nous avons quantifié l’expression de GALIG dans le groupe M0-M4, ainsi que l’expression des différents partenaires de GALIG, GABARAP, GABARAPL1, Bécline-1/BECN1, LC3b et p62/SQSTM1, dans les cellules mononucléées de la moelle osseuse (Figure 33).
On observe une sous-expression significative du gène GALIG (p = 0,0065) dans les cellules de la moelle osseuse de patients atteints de LAM au diagnostic (médiane = 40 copies) par rapport au prélèvement post-cure de chimiothérapie (médiane = 113 copies) (Figure 32, en haut à gauche).
Pour les gènes LC3B, GABARAPGABARAPL1, Bécline-1/BECN1 et p62/SQSTM1, nous n’avons observé aucune différence d’expression entre le diagnostic et le traitement post-cure dans le groupe de LAM M0-M4 (Figure 32).
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Figure 33 : Expression de GALIG et des gènes impliqués dans l’autophagie, dans la moelle osseuse du groupe M0-M4
Le nombre de copies d’ARNm par ng d’ARN totaux a été mesuré par ddPCR, dans les cellules de la moelle osseuse (MO), au diagnostic (Diagnostic) et post-cure de chimiothérapie (Post-cure).
ARNm GALIG en haut à gauche, ARNm LC3B en haut à droite, ARNm GABARAP au milieu à gauche, GABARAPL1 au milieu à droite, ARNm Bécline-1/BECN1 en bas à gauche et ARNm p62 en bas à droite.
Test de Mann Whitney, légende de la figure se reporter Figure 28, *p<0,05 ; **p<0,01, ***p<0,001 et ns = non significatif. n = effectifs par groupe.
En conclusion, au niveau du groupe qui représente les blocages de différenciation allant du myéloblaste avec différenciation minimale (M0) au myélomonocyte (M4) nous n’avons observé aucune différence significative d’expression des gènes impliqués dans l’autophagie au diagnostic de la LAM et après le traitement de chimiothérapie. Le seul niveau d’expression significativement différent concerne celui du gène GALIG, qui est quant à lui très inférieur dans la moelle leucémique, comparé à celui observé après la cure de chimiothérapie.
103 b) Au niveau du sang :
De la même façon, nous avons quantifié l’expression de GALIG et des gènes GABARAP, GABARAPL1, Bécline-1/BECN1, LC3B et p62/SQSTM1, impliqués dans l’autophagie, dans les cellules mononucléées du sang des patients du groupe M0-M4 (Figure 34). Nous avons également pu comparer ces prélèvements à des prélèvements-contrôles issus de donneurs sains.
Comparaison entre les prélèvements sanguins au diagnostic et post-cure de chimiothérapie :
Comme observé dans les cellules de la moelle osseuse, on note une sous-expression significative de GALIG (p = 0,000047) dans le sang au diagnostic (médiane
Figure 34 : Expression de GALIG et des gènes impliqués dans l’autophagie, dans le sang du groupe M0-M4
Le nombre de copies d’ARNm par ng d’ARN totaux a été mesuré par ddPCR, dans les cellules du sang, au diagnostic (Diagnostic), post-cure de chimiothérapie (Post-cure) et chez les donneurs sains (Contrôle).
ARNm GALIG en haut à gauche, ARNm LC3B en haut à droite, ARNm GABARAP au milieu à gauche, GABARAPL1 au milieu à droite, ARNm Bécline-1/BECN1 en bas à gauche et ARNm p62/SQSTM1 en bas à droite.
Test de Mann Whitney, légende de la figure se reporter Figure 28, *p<0,05 ; **p<0,01, ***p<0,001 et ns = non significatif. n = effectifs par groupe.
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= 16 copies), par rapport aux prélèvements post-cure (médiane = 123 copies) (Figure 33, en haut à gauche). Par contre, aucune différence significative n’est observée, entre les taux d’expression au diagnostic et ceux après le traitement post-cure de chimiothérapie pour les gènes dosés impliqués dans l’autophagie. (Figure 34, haut/gauche)
Comparaison entre les prélèvements sanguins au diagnostic et issus de donneurs sains :
On note également une sous-expression de GALIG (p = 0,00017), observée lorsqu’on compare son taux au diagnostic (médiane = 16 copies) par rapport au sang issu de donneurs sains (médiane = 74 copies). De plus, on observe une sous-expression au diagnostic de la leucémie en comparaison aux donneurs sains pour les gènes GABARAP, GABARAPL1, et Bécline/BECN1, et une surexpression des gènes LC3B et p62/SQSTM1, au diagnostic par rapport aux donneurs sains (Figure 34).
Comparaison entre les prélèvements sanguins post-cure et issus de donneurs sains : Par contre, on n’observe aucune différence significative entre le dosage du sang de patients après la cure de chimiothérapie et celui de donneurs sains pour les gènes GALIG, GABARAP et p62/SQSTM1. Par contre, comme pour le sang au diagnostic et celui des donneurs sains, LC3B est surexprimé post-cure de chimiothérapie en comparaison au sang contrôle, et Bécline-1/BECN1 et GABARAPL1 sont quant à eux sous-exprimés.
En conclusion, l’envahissement du compartiment sanguin par les blastes immatures en excès de la MO conduit inévitablement à des différences significatives d’expression pour ces 6 gènes étudiés entre le diagnostic de la LAM et le sang contrôle.
L’expression de GALIG, GABARAP, GABARAPL1 et BECLINE est diminuée, alors que l’expression de LC3B et p62 est plus forte. Après chimiothérapie seul les gènes GABARAP,p62 et GALIG retrouvent le même taux d’expression que le sang contrôle.
B. Groupe M5 :
Le groupe des LAM de type M5 est un groupe très hétérogène en termes de population cellulaire. En effet, dans la LAM 5a, on observe la présence de monoblastes indifférenciés et dans la forme 5b, la présence majoritaire de blastes différenciés,
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monocytaires. Le taux d’expression de GALIG dans la moelle osseuse varie pour ces patients de 6 copies à 394 copies par nanogramme d’ARN, (Tableau 7). Nous observons également de très forte hétérogénéité d’expression pour les gènes impliqués dans l’autophagie : LC3B (1178-3280 copies par ng d’ARN), GABARAPL1 (204-1031 copies par nanogramme d’ARN), p62 (984-3420 copies par nanogramme d’ARN), BECLINE (492-1390 copies par nanogramme d’ARN) et GABARAP (3080-10960 copies par nanogramme d’ARN).
Tableau 7 : Nombre de copies d’ARNm/ng d’ARN totaux dans les cellules de patients atteints de LAM-M5 Colonne 1 : n° d’identification de la LAM, colonne 2 : % de blastes dans la moelle osseuse au diagnostic, colonne 3 : types de LAM selon la classification FAB (Franco-Américano-Britannique), colonne 4 à 9 : nombres de copies d’ARNm par nanogramme d’ARN totaux, les cases blanches correspondent aux valeurs minimum et maximum. En bas, les médianes, le 25ème et 75ème quartile correspondant aux différents gènes dosés.
Nous ne pouvons donc malheureusement pas conclure quant à l’expression de GALIG et ses partenaires dans les LAM-M5 en raison du très fort taux de variation d’expression de ces gènes.
C. Groupe M6 :
Pour le groupe des LAM de type M6 nous n’avons obtenu qu’un seul prélèvement issu de la moelle osseuse de ce patient. Ce patient a un pourcentage d’érythroblastes de 82% dans la moelle osseuse. Le taux d’expression de GALIG reste faible, avec 47 copies d’ARNm par nanogramme d’ARN totaux (Tableau 8), au même niveau que celui observé pour le groupe des LAM-M0 à LAM-M4. De plus, l’expression des gènes dosés, impliqués
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dans l’autophagie semble être inférieure à celle des LAM-M0 à LAM-M4, de 2 fois pour LC3B et GABARAPL1 et de 4 fois pour Bécline, p62 et GABARAP.
Tableau 8 : Nombre de copies d’ARNm dans les cellules du patient atteint d’une LAM-M6
Colonne 1 : n° d’identification de la LAM, colonne 2 : % de blastes dans la moelle osseuse au diagnostic, colonne 3 : types de LAM selon la classification FAB (Franco-Américano-Britannique), colonne 4 à 9 : nombres de copies d’ARNm par nanogramme d’ARN totaux.
GALIG et plusieurs gènes impliqués dans l’autophagie semblent s’exprimer plus faiblement dans cette leucémie érythrocytaire. Mais sans donnée complémentaire, comme d’autres prélèvements de LAM-M6 et le retour post-cure de ce patient, nous ne pouvons pas conclure quant au taux d’expression de ces gènes.