Interactions avec des modèles de membrane

A. Introduction

Afin de comprendre l’influence des propriétés physicochimiques des NPs et de leur recouvrement de surface sur les effets cellulaires, les NPs peuvent être mises au contact de modèles membranaires. L’étude des interactions des NPs avec des modèles membranaires peut permettre de comprendre l’interface entre les NPs et les cellules.

Interface entre les NPs et les milieux biologiques

Les effets biologiques des NPs sont dépendants de la taille, la charge de surface, ou la composition des NPs. Ces propriétés influencent la composition et la taille de la couronne de protéines qui se forme autour des NPs (Walczyk et al., 2010). Cette couronne est ce que « voit » finalement la cellule, ce avec quoi elle interagit, dans les milieux biologiques (Nel et al., 2009). A l’interface entre les NPs et les milieux biologiques, les interactions sont multiples, de type stériques, hydrophobes, hydrodynamiques, électrodynamiques, et électrostatiques (Nel et al., 2009). Etudier l’interface entre les NPs et les milieux biologiques pourrait permettre une meilleure prévision des effets biologiques, in

vitro et in vivo. Pour comprendre cette interface, différents modèles de membrane cellulaire ont été

développés. L’utilisation de modèles permet de différencier le type de forces impliquées dans les interactions NPs-membrane cellulaire et les effets résultants. Ces modèles membranaires peuvent être des vésicules lipidiques supportées ou en suspension, de différentes taille, charge, composition, ou bien des bicouches lipidiques, supportées ou libres (Chen and Bothun, 2013). Des modèles mathématiques ont également été développés pour modéliser les interactions entre NPs et membranes cellulaires à l’échelle atomique ou moléculaire. Pour les études utilisant des modèles membranaires, le milieu environnant les NPs et les membranes sont contrôlés par l’expérimentateur. La température, la composition du milieu, le pH, l’exposition à une source lumineuse, la composition lipidique du modèle sont définis en début d’expérience. Il est ainsi possible de distinguer les effets liés à l’agrégation des NPs, à la sédimentation, à la présence ou non de protéines. A l’aide des modèles membranaires, des effets tels que l’adhésion des NPs à la membrane, l’insertion des NPs dans la partie hydrophobe de la bicouche lipidique, la formation d’une vésicule « d’internalisation », un effet de « gélation » des lipides membranaires, ou encore la formation de pores peuvent être observés (Rascol et al., 2016). Les modèles utilisés pour étudier les interactions NPs-membrane sont souvent composés uniquement de lipides, et ne représentent donc que la partie lipidique d’une membrane cellulaire (Bailey et al., 2015; Liu and Chen, 2015; Wang et al., 2016; Yi and Chen, 2013). Les effets observés sont donc des effets non spécifiques. Afin de mettre en évidence des interactions spécifiques, certaines

134 études ont été faites après reconstitution de protéines au sein du modèle membranaire (Canovi et al., 2012; Peetla et al., 2009; Schneider et al., 2015). Les interactions spécifiques ont été étudiées par la mesure de la tension de surface en fonction de l’aire moléculaire (P = f(A)) en utilisant la balance de Langmuir, sur des monocouches lipidiques (Peetla et al., 2009) ou par résonnance plasmonique de surface (RPS) (Schneider et al., 2015). Si l’association de plusieurs méthodes différentes est généralement nécessaire pour comprendre l’interface NPs-membranes cellulaires, la QCM-D pourrait être la méthode permettant les expériences les plus diverses, et qui apporte les données les plus complètes.

La microbalance à quartz QCM-D : un outil de caractérisation à l’échelle nanométrique

Le principe de la QCM-D est basé sur le phénomène de piézoélectricité inverse : un champ électrique appliqué à un cristal de quartz va induire une oscillation du quartz à une fréquence précise. La fréquence d’oscillation diminue si la masse déposée à la surface du quartz augmente. La sensibilité de la microbalance à quartz est de l’ordre du ng cm-2 en milieu liquide (Cheng et al., 2012). Le champ électrique appliqué est alternatif : à chaque arrêt du courant, l’oscillation va progressivement s’arrêter. Ce phénomène est dû à la dissipation d’énergie. Plus le matériau déposé à la surface sera viscoélastique, plus la dissipation de l’oscillation sera rapide. La QCM-D permet donc d’évaluer des variations de masse, sur une surface en milieu liquide, et mesure les propriétés viscoélastiques du matériau. Cette technique est particulièrement adaptée à l’étude de films homogènes, afin d’en étudier la masse, l’épaisseur, la viscoélasticité.

Le dépôt des vésicules lipidiques sur une surface a été largement étudié par QCM-D (Keller and Kasemo, 1998; Richter et al., 2003). Cette méthode a permis de mettre en évidence les différentes étapes et les paramètres influençant la formation d’une bicouche lipidique à partir de vésicules (Richter et al., 2006). Les vésicules se déposent sur la surface, formant un film relativement homogène de vésicules lipidiques supportées, caractérisé par une diminution importante de la fréquence d’oscillation, et une forte dissipation. La dissipation est due à l’importante proportion d’eau dans les vésicules intactes déposées à la surface, au degré d’hydratation du film. En fonction de la composition du tampon, de la taille des vésicules, de la surface, les vésicules vont ensuite fusionner entre elles pour former des bicouches lipidiques supportées (SLB) ou rester sous la forme de vésicules lipidiques supportées (SLV). Deux types de modèles membranaires peuvent ainsi être formés sur les surfaces de QCM-D : des SLV et des SLB. La composition lipidique, la température, et le milieu sont contrôlés. Suite à de nombreux travaux sur l’étude du dépôt de vésicules lipidiques sur différentes surfaces en QCM-D, cette technique a été développée pour la caractérisation des NPs (Johannsmann et al., 2009). La sensibilité de l’évaluation de la masse en milieu liquide présente un intérêt majeur pour l’étude du

comportement des NPs en suspension. L’enregistrement en temps réel des variations de masse permet de connaitre les cinétiques de dépôt de différentes NPs. Les cinétiques de dépôt de NPs d’oxyde de fer de 8 nm stabilisés par une bicouche d’acide oléique ont été étudiées sur des surfaces planes de silice, de polystyrène et poly-L-lysine (PLL) (Li et al., 2014). La vitesse de dépôt des NPs est supérieure sur la surface de polystyrène par rapport à la surface de silice, en raison d’interactions hydrophobes entre les NPs d’oxyde de fer et la surface de polystyrène. La rigidité du film de NPs déposées sur la surface de polystyrène ne varie pas avec la concentration en NaCl ou CaCl2 du milieu. A l’inverse, sur les surfaces de silice et de PLL, le ratio variation de dissipation sur variation de fréquence augmente, indiquant une augmentation de la dissipation et donc une diminution de la rigidité du film de NPs formé. Le dépôt des NPs sur la surface de polystyrène fait intervenir des interactions hydrophobes, tandis que le dépôt sur la surface de silice implique des interactions électrostatiques. Ainsi, le film de NPs formé sur la surface de silice en présence d’une forte concentration de NaCl est moins stable que celui formé par la présence d’une forte concentration de Ca2+, par interaction électrostatique entre les NPs et la surface de silice, chargées négativement. Les agrégats de NPs déposés à la surface en présence de cations divalents induit une plus grande interaction entre les NPs et la surface, par liaison ionique. Le dépôt de NPs de silice colloïdale sous la forme de Laponite (disques de 25 nm de diamètre sur 0.25 nm de hauteur) et de Ludox (sphères de 20 nm de diamètre) a été comparé sur une surface recouverte de polymère cationique (PDADMAC : poly(diallyldimethylammonium chloride) en utilisant la technique de QCM-D (Xu et al., 2010). La variation de fréquence a permis de montrer que les NPs s’adsorbaient d’autant plus que la concentration augmentait, jusqu’à une saturation à partir de 1015 NPs L-1. A cette concentration, la masse de NPs de Ludox adsorbée à la surface est plus de 2 fois supérieure à celle de Laponite. L’étude de la dissipation a montré des mécanismes d’interaction différents entre les deux types de NPs et le film cationique de polymère. En effet, la dissipation augmente légèrement (< 2 .10-6) et régulièrement avec la concentration de NPs de Laponite. En revanche, lorsque la « concentration » en Ludox arrive à 1015 NPs L-1, concentration de saturation de la surface en NPs, la dissipation augmente, passant de 3 .10-6 à 20 min, à 5 .10-6 à 100 min et 6 .10-6 à 180 min. La forme de disque des NPs de Laponite permettrait l’arrangement des NPs en un film plus compact lors du dépôt que les NPs sphériques de Ludox. L’interaction des NPs de Ludox avec le film de polymère induirait, à la concentration de saturation de la surface en NPs, un réarrangement à l’interface entre les NPs et le film cationique de PDADMAC, modifiant ainsi les propriétés viscoélastiques du film. Des cinétiques de dépôt de NPs sur différentes surfaces, en fonction de la charge de surface, de la composition du tampon ont été réalisées. L’influence de la chimie de surface et du milieu a été mise en évidence sur la cinétique de dépôt des NPs (Quevedo et al., 2013). Le dépôt des QD de CdSe et de CdTe et des NPs de polystyrènes, de tailles comprises entre 20 et 30 nm, et modifiés en surface par différents

136 groupements, a été ainsi comparé sur une surface d’alumine Al2O3. Les NPs ont été mises en suspension en milieu aqueux contenant 0,1, 1, 10, 20 ou 100 mM de KCl. Le traitement au préalable de la surface d’alumine Al2O3 avec des molécules organiques modifie la cinétique de dépôt des NPs et la dissipation, en formant une barrière électro-stérique entre les NPs et la surface.

L’augmentation de la dissipation lors du dépôt de NPs est généralement attribuée à un phénomène d’hydratation du film de NPs à la surface (Bingen et al., 2008). Afin d’évaluer le degré d’hydratation, la quantité de solvant aqueux emprisonnée dans le film, la méthode de QCM-D est parfois associée à des méthodes optiques, telles de l’ellipsométrie, la RPS (Reviakine et al., 2011) ou la réflexométrie (Bingen et al., 2008).

Suivi d’interaction de NPs avec des bicouches lipidiques

L’interaction entre des NPs et des SLB ou SLV comme modèles membranaires peut être suivie en temps réel, et en conditions contrôlées. L’adhésion de nanotubes de carbone (NTC) a été étudiée sur ces deux modèles (Yi and Chen, 2013). Les ions en solution dans le milieu influencent le dépôt des NTC sur une bicouche lipidique de DOPC. En effet, en présence de NaCl, le dépôt augmente progressivement jusqu’à une concentration en sel supérieure à 1 M, indiquant la présence d’un équilibre entre les forces d’attraction et les forces de répulsion. Au fur et à mesure que la concentration en NaCl augmente, la double couche électrique à la surface des NPs est réduite, favorisant l’attraction avec la bicouche lipidique. A une concentration en NaCl de 1 mM, les NTC ne se déposent pas à pH de 4,3. En revanche, si le pH est à 2, la charge de surface de la bicouche lipidique devient positive, favorisant le dépôt des NTC chargés négativement. Lorsque les NTC sont mis en présence de CaCl2, ils se déposent rapidement dès la concentration de 0,2 mM de CaCl2, à pH 7,3. Les ions Ca2+ s’accumuleraient au niveau des têtes polaires des lipides, chargées négativement. La présence du cation divalent à la surface de la bicouche lipidique semble modifier la charge de surface pour la rendre positive, facilitant ainsi l’attraction électrostatique des NTC au niveau de la bicouche lipidique. Après avoir défini les conditions favorisant le dépôt des NTC sur une SLB de DOPC, les NTC ont été mis en contact avec une SLV de DOPC. Le dépôt des NTC sur les vésicules immobilisées n’entraine pas de rupture des vésicules. En effet, la rupture des vésicules induirait une réduction de la dissipation et une augmentation de la fréquence, par relargage de l’eau qu’elles contiennent. Le même type d’étude a été réalisé avec des particules d’oxyde de graphène (OG), de taille comprise entre 0,5 et 5 µm (Liu and Chen, 2015). Dans ce cas, les particules se déposent sur une SLB de DOPC à partir d’une concentration de 100 mM de NaCl ou de 1 mM de CaCl2. A des concentrations en sel légèrement inférieures, la dissipation est très importante, indiquant un équilibre entre la répulsion apportée par la double couche électrique et l’attraction par des forces de Van der Waals entre les NPs et la SLB. Au-delà de ces concentrations, la barrière d’énergie de répulsion par la couche d’hydratation

est supprimée, favorisant le dépôt des particules. Dans des conditions permettant le dépôt des OG sur une SLV de DOPC, aucune rupture des vésicules n’est observée. En revanche, la carboxyfluorescéine préalablement encapsulée dans le compartiment aqueux des vésicules est détectée, probablement due à la libération du marqueur fluorescent indiquant la formation de pores induite par les OG. Avec certaines NPs, les forces d’interaction sont tellement importantes que des lipides de la bicouche lipidique s’attachent aux NPs et se détachent du modèle membranaire, entrainés avec la NPs (Bailey et al., 2015). Ce phénomène a été observé lors de l’incubation de NPs d’or de 10 et de 40 nm avec une SLB de EPC, en présence d’acide poly méthacrylique. Ce polymère est ajouté dans le milieu au-dessus de la bicouche lipidique, pour mimer la matière organique naturelle (protéines par exemple), puis les NPs sont ajoutées. La présence du polymère induit une importante perte de masse à partir du film de lipides déposé à la surface, en présence des NPs. Cette observation est liée aux propriétés hydrophobes des NPs. En présence de polymère, les NPs sont plus attirées par la bicouche lipidique. Les auteurs émettent l’hypothèse que les NPs les plus petites (10 nm), restent collées, stabilisées par le polymère dans la partie hydrophobe de la bicouche lipidique, tandis que les NPs de 40 nm se recouvrent de bicouches lipidiques, et décrochent les lipides de la bicouche lipidique. L’influence de la présence de protéines, et non d’un polymère mimant la matière organique, a également été étudiée lors du dépôt de NPs d’argent sur une SLB de DOPC (Wang et al., 2016). Un seul type de protéine a été ajouté au milieu, l’albumine de sérum humain (HSA). A pH 7, la présence de HSA réduit significativement le dépôt des NPs d’argent sur la bicouche lipidique. Inversement, à pH 2, la HSA favorise le dépôt des NPs d’argent. A pH 2 et à force ionique élevée (150 mM NaCl), les forces d’attraction de Van der Waals dominent sur la répulsion électrostatique entre les NPs et la SLB.

Dans ce travail de thèse, le dépôt des Fe3O4@MSN natives, PEG-Fe3O4@MSN et DMPC-Fe3O4@MSN a été étudié sur un modèle de SLB de EPC.

B. Résultats

L’influence de la concentration en NaCl a été étudiée en présence de NaCl 5 et 150 mM, à pH 7,4. Une bicouche lipidique est formée à partir de liposomes composés de lipides EPC, en tampon HBS 150 mM NaCl (Hepes 20 mM, pH 7,4). La bicouche lipidique formée sur surface SiO2 en QCM-D est une bicouche lipidique supportée ou SLB, composée de lipides EPC purs. La bicouche lipidique formée sur surface d’or en RPS est composée de lipides EPC et 5% en masse du lipide d’ancrage DSPE-PEG-SPA. Ce type de bicouche lipidique ancrée et découplée du support est appelé tBLM. Les deux modèles membranaires sont laissés au repos au minimum 1 h avant de poursuivre les expériences. Avant d’ajouter les NPs au-dessus de la bicouche lipidique, le milieu de suspension des NPs est

138 préalablement ajouté seul, afin d’estimer les variations de fréquence vis à vis de la bicouche lipidique, indépendamment de la différence de force ionique (Frost et al., 2013). Des protéines de sérum de veau fœtal (SVF 10 %) ont été ajoutées au tampon HBS 150 mM NaCl (Hepes 20 mM, pH 7,4), pour se placer dans des conditions proches du milieu de culture cellulaire.

Suivi par QCM-D et RPS du dépôt des NPs sur les membranes modèles

Le dépôt des Fe3O4@MSN natives, PEG-Fe3O4@MSN et DMPC-Fe3O4@MSN sur des modèles membranaires composés de lipides EPC a été suivi par RPS et QCM-D. En RPS, la tBLM est formée sur le support d’or par ancrage d’un lipide fonctionnalisé dans la bicouche de lipides EPC, contrairement au modèle de SLB utilisé en QCM-D composé exclusivement de lipides EPC. Les résultats sont présentés à partir de la bicouche lipidique équilibrée en présence du tampon de dispersion des NPs.

Figure 51 : Suivi de l’interaction des NPs avec une SLB par mesure de la variation de fréquence f7/7 et de la dissipation D7 par QCM-D.

Les interactions des NPs sur une SLB de EPC préalablement formée sur surface SiO2 sont suivies en temps réel pendant 2 h. Les Fe3O4@MSN natives (bleu), PEG-Fe3O4@MSN (orange) et DMPC-Fe3O4@MSN (rouge) sont mises en contact par aspiration avec le modèle de SLB en tampon a) NPs en tampon HBS 5 mM NaCl (Hepes 20 mM, pH 7,4) à une « concentration » de 0,1 mg mL-1, b) NPs en tampon HBS 150 mM de NaCl (Hepes 20 mM, pH 7,4) à une « concentration » de 0,1 mg mL-1, c) NPs en tampon HBS 5 mM NaCl (Hepes 20 mM, pH 7,4) à une « concentration » de 0,25 mg mL-1, et d) NPs en tampon HBS 150

mM de NaCl (Hepes 20 mM, pH 7,4) à une « concentration » de 0,25 mg mL-1. Les courbes décrites correspondent à une expérience-type, pour chaque condition.

Lorsque le flux est arrêté après l’ajout des NPs, celles-ci continuent de se déposer, plus lentement, au cours des deux heures de l’expérience (Fig. 51). Au bout de 2 h, La variation de fréquence induite par le dépôt des NPs atteint un plateau et ne varie quasiment plus. A une concentration de 5 mM de NaCl, la variation de fréquence Δf7/7 par rapport à la SLB à 2 h est de -201 Hz à 0,1 mg mL-1 contre -340 Hz à 0,25 mg mL-1, pour les NPs natives Fe3O4@MSN. Pour les NPs PEG Fe3O4@MSN, la variation de fréquence est de -10 Hz et -35,9 Hz pour les « concentrations » en NPs de 0,1 et 0,25 mg mL-1, respectivement. Pour les NPs DMPC Fe3O4@MSN, la variation de fréquence par rapport à la SLB à 2 h n’est pas significative pour une concentration de 5 mM de NaCl. A une concentration de 150 mM de NaCl, la variation de fréquence Δf7/7 par rapport à la SLB à 2 h est de -125 Hz à 0,1 mg mL^-1 et -381 Hz à 0,25 mg mL-1, pour les NPs natives Fe3O4@MSN. Pour les NPs PEG Fe3O4@MSN, la variation de fréquence est de -2,6 Hz et -1,47 Hz pour les « concentrations » de 0,1 et 0,25 mg mL-1, respectivement. Pour les NPs DMPC Fe3O4@MSN, la variation de fréquence est de -1,9 Hz et -9 Hz pour les « concentrations » de 0,1 et 0,25 mg mL-1, respectivement. En présence de 5 ou de 150 mM de NaCl, les NPs natives sont les NPs qui induisent la plus forte variation de fréquence et de dissipation, et donc sont celles qui se déposent le plus.

Pour déterminer les masses de NPs adsorbées, le modèle de Kelvin Voigt n’est pas applicable, car les NPs ne forment pas un film homogène. L’équation de Sauerbrey est appliquée pour une estimation approximative des masses de NPs déposées, sachant que le rapport ΔD7/(-Δf7/7) est supérieur à 4 10 -6, limite d’applicabilité de l’équation de Sauerbrey selon Reviakine (Reviakine et al., 2011). L’augmentation de la dissipation lors du dépôt de NPs est attribuée à la solvatation du film des NPs déposées à la surface (Bingen et al., 2008). Lorsque les NPs se déposent, la proportion de milieu aqueux emprisonnée entre les NPs est indissociable de la couche de NPs mesurée par la variation de fréquence. Afin d’évaluer la masse de NPs réellement adsorbées à la surface, les NPs ont été mises au contact d’une bicouche lipidique de composition voisine sur un système RPS. La surface de contact entre la bicouche lipidique et les NPs est la même pour les deux systèmes, de 1,54 cm2, mais le volume est différent. En RPS, le volume de la cellule de mesure est de 923,6 µL, contre 40 µL. La même concentration et le même volume de NPs est ajouté au-dessus de la bicouche lipidique pour les deux systèmes, pour rester dans des conditions voisines.

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Figure 52 : Suivi de l’interaction des NPs avec une tBLM par mesure de la réflectivité en RPS.

Les interactions des NPs sur une tBLM de lipide EPC préalablement formée sur surface d’or sont suivies en temps réel pendant 2 h. Les NPs sont mises en contact avec le modèle de tBLM en tampon a) HBS 5 mM NaCl (Hepes 20 mM, pH 7,4)et b) 150 mM