Interaction des NPs avec les membranes cellulaires : apport des modèles membranaires

L’interaction des NPs présentant différentes surfaces avec les modèles membranaires a été étudiée en utilisant trois approches différentes sur les mêmes données, obtenues avec le protocole de dépôt en tampon sans protéines. Les cinétiques d’interaction ont été enregistrées en temps réel. Les données brutes des variations de fréquence et de dissipation en QCM-D et de variation de réflectivité en RPS nous montrent l’évolution de l’interaction des NPs avec les modèles membranaires au cours du temps. Les masses finales adsorbées après deux heures d’interaction sur les deux modèles ont été estimées à l’aide de modèles mathématiques. Elles ont ensuite été mises en relation, afin de mettre en évidence le degré d’hydratation de la couche de NPs déposée au-dessus de la bicouche lipidique. Enfin, les données brutes obtenues à la fin du dépôt des NPs sur la bicouche lipidique sont analysées en s’affranchissant de modèles mathématiques. Les caractéristiques du dépôt des NPs en fonction de la chimie de surface, de la concentration, et de la force ionique du tampon sont obtenues à partir de la vitesse de dépôt et du rapport de la dissipation sur la fréquence ΔD7/(-Δf7/7).

Ces trois approches ont permis de montrer que les NPs natives interagissaient fortement avec les bicouches lipidiques, en présence d’une force ionique élevée ou faible. Les NPs se déposent en emprisonnant une masse importante d’eau induisant une forte dissipation mesurée lors du dépôt. L’état d’agrégation important des NPs natives en tampon HBS 150 mM de NaCl (Hepes 20 mM, pH 7,4) n’influence pas la proportion d’eau emprisonnée lors du dépôt. Le dépôt est plus lent et la dissipation plus importante lorsque la force ionique est élevée. Lorsque les NPs sont mises en suspension dans du tampon HBS 150 mM NaCl (Hepes 20 mM, pH 7,4) contenant 10% SVF, il se forme une couronne de protéines autour des NPs. Cette couronne de protéines forme un encombrement stérique stabilisant les NPs natives en suspension et limite leur interaction avec la bicouche lipidique. Les NPs PEG-Fe3O4@MSN se déposent sur les modèles membranaires uniquement en condition de faible force ionique. Les NPs PEG n’interagissent pas beaucoup avec la bicouche lipidique à une force ionique élevée en présence ou en absence de protéines. Contrairement aux NPs natives, la présence des protéines ne modifie pas l’interaction des PEG-Fe3O4@MSN avec la bicouche lipidique. Le degré d’hydratation du dépôt des PEG-Fe3O4@MSN est comparable à celui des DMPC-Fe3O4@MSN, et faible en comparaison des NPs natives.

Comme pour les PEG-Fe3O4@MSN, l’interaction des DMPC-Fe3O4@MSN avec les modèles membranaires n’est pas influencée par la présence de protéines, et le degré d’hydratation du dépôt

162 est faible en comparaison des Fe3O4@MSN natives. Les DMPC-Fe3O4@MSN se déposent rapidement sur le modèle membranaire, avec une dissipation importante du dépôt des DMPC-Fe3O4@MSN sur le modèle membranaire.

Ces différentes observations permettent de conclure que :

- la toxicité des Fe3O4@MSN natives n’est pas due à une forte interaction avec la bicouche lipidique

- l’interaction des NPs avec la bicouche lipidique n’est pas dépendante de l’état d’agrégation des NPs, mais serait principalement due à la chimie de surface des NPs

- l’interaction des PEG-Fe3O4@MSN et DMPC-Fe3O4@MSN avec la bicouche lipidique n’est pas influencée par la présence de protéines dans le milieu d’incubation

II. Perspectives

Ce travail laisse entrevoir de nombreuses perspectives, pour approfondir les résultats et avancer dans le développement de ces NPs pour des applications médicales.

A. Compréhension de l’interface NPs-membranes

Les résultats intéressants obtenus en QCM-D montrent l’intérêt de ce type de méthode pour comprendre l’interface NPs-membranes. D’autres tests peuvent être réalisés pour comprendre l’interface NPs-membranes, pour mettre en évidence les effets des NPs sur la fluidité ou la rupture membranaire. Le débit de circulation et la composition de la bicouche lipidique peuvent également être modifiés pour approfondir les effets des NPs sur les membranes cellulaires. De plus, les méthodes utilisées pour comprendre l’interface entre les Fe3O4@MSN et les milieux biologiques pourraient être appliquées et validées avec les NPs d’analogues de bleu de Prusse.

Autres tests d’interaction avec les modèles membranaires

L’étude de l’interaction des NPs avec les modèles membranaires permet de mettre en évidence l’affinité des NPs pour les membranes cellulaires, les types de forces d’interaction mises en jeu, les effets des NPs sur les membranes cellulaires, et le type de complexe formé entre la NP et la membrane cellulaire (Fig. 59). Les effets des NPs sur les membranes peuvent être : un effet de gélation, d’enrobage autour des NPs, ou la formation de pores. Ces différents mécanismes peuvent être mis en évidence par QCM-D (Bailey et al., 2015; Liu and Chen, 2015; Wargenau and Tufenkji, 2013; Yi and Chen, 2013).

Figure 59 : Mécanismes d’interaction des NPs avec les membranes cellulaires.

1- affinité ou répulsion, 2- le type de forces d’interaction, 3- Les effets sur les lipides : effet de gélation, enrobage des NPs, formation de pores, 4- Le mécanisme d’interaction : simple adhésion ou dépôt, intégration au cœur de la bicouche lipidique ou internalisation dans une vésicule. Schéma extrait de la revue Rascol et al. 2016.

a) Influence des NPs sur la fluidité membranaire

Les NPs peuvent modifier la fluidité membranaire, par adhésion aux phospholipides. L’altération de la mobilité membranaire peut être suivie par FRAP (retour de fluorescence après photoblanchiment). Cette méthode peut être appliquée sur un modèle de bicouche lipidique supportée ou de vésicules lipidiques géantes. Des NPs de silice de 18, 78 et 180 nm ont ainsi été comparées sur un modèle de vésicule lipidique géante de DOPC (Zhang et al., 2012b). Les résultats de cette étude montrent une réduction de la mobilité latérale des lipides par les NPs de 18 nm, tandis que les NPs de 78 et 182 nm induisent une augmentation de la mobilité. L’effet de gélation des NPs de 18 nm sur les membranes a également été démontré par DSC. La température de transition (Tm) des lipides DMPC et DMTAP, seuls ou mélangés, est réduite au contact de NPs de silice de 100 nm. Lorsque les vésicules sont en large excès par rapport aux NPs, les Tm des liposomes seuls et celle des lipides au contact des NPs sont distinctes (Ahmed et al., 2012).

Cet effet de gélation des NPs sur les lipides membranaires peut être suivi par QCM-D (Fig. 59-3). En effet, il est possible de faire varier la température dans la cellule de mesure, de faire une rampe de

164 température pour déterminer la Tm des lipides déposés à la surface. La dissipation diminue de façon linéaire avec l’augmentation de la température, tandis que la fréquence est uniquement réduite à la température de transition des lipides (Ohlsson et al., 2011; Wargenau and Tufenkji, 2013). Les variations de fréquence et de dissipation sont à enregistrer en présence et en absence de membrane, car une partie des variations est attribuée aux variations de viscosité du milieu. Il est possible d’évaluer les variations de Tm sur SLB (Wargenau and Tufenkji, 2013) ou SLV (Ohlsson et al., 2011).

b) Autre modèle supporté de membrane

L’attraction ou le dépôt de NPs sur les membranes peut également être évalué avec un modèle de vésicules lipidiques supportées (SLV). L’adhésion des NPs aux lipides membranaires peut induire une variation de la fluidité membranaire, mais également la formation de pores (Fig. 59-3). En effet, si les forces d’interaction sont très importantes, ou en fonction de la taille des NPs, il peut il y avoir rupture temporaire de la barrière formée par la bicouche lipidique. Cet effet est généralement étudié par encapsulation d’une molécule fluorescente dans le compartiment aqueux interne d’une vésicule lipidique. Si de la fluorescence est détectée à l’extérieur de la vésicule au contact d’une NP, l’interaction induit une rupture de la bicouche lipidique. Cette technique a permis de montrer l’effet de rupture membranaire par des NPs d’or de 2 nm, sur des vésicules lipidiques formées de lipides anioniques ou neutres (Goodman et al., 2004). La formation de pores peut également être enregistrée par mesures électriques. En effet, si la bicouche lipidique est perméable aux ions, c’est qu’il y a formation d’un pore (Negoda et al., 2013). Ces expériences peuvent être réalisées sur bicouche lipidique supportée (Liu et al., 2014b) ou libre (Carney et al., 2013).

En QCM-D, la quantité d’eau emprisonnée avec le film déposé en surface peut être estimée, à l’aide de la dissipation. Lorsque des vésicules lipidiques sont déposées sur une surface en QCM-D, il y a une forte variation de fréquence et de dissipation en raison de l’eau emprisonnée dans les vésicules. Au contact des NPs, il est possible de mettre en évidence le simple dépôt des NPs, le relargage de grosse quantité d’eau par la rupture complète des vésicules, ou encore de doser la libération progressive du contenu interne des vésicules. Il a ainsi été démontré que les NTC et les NPs d’OG ne produisaient pas de rupture complète des vésicules lipidiques supportées (Yi and Chen, 2013), mais une libération de fluorochrome due à la formation transitoire de pores a été détectée (Liu and Chen, 2015; Liu et al., 2014b).

c) Variation du débit de circulation

L’interaction des NPs avec les membranes cellulaires est différente lorsque l’exposition est statique ou en flux. En effet, l’agrégation des particules induit progressivement une sédimentation, et donc un dépôt des NPs sur la membrane des cellules. L’exposition statique des cellules est un inconvénient

majeur des études in vitro habituellement réalisées. En effet, les NPs finissent par se déposer sur la membrane des cellules, pouvant conduire à des artefacts dans les résultats d’internalisation et de viabilité cellulaire (Alkilany et al., 2016). En QCM-D, il est possible d’adapter le débit de circulation des milieux au-dessus des modèles membranaires, ou même de cellules. En effet, il est également possible de détecter des effets cellulaires par QCM-D (Lesniak et al., 2013; Nowacki et al., 2014)

d) Variation de la composition de la bicouche lipidique

Un des avantages majeur de l’utilisation de modèles membranaires est de pouvoir contrôler l’ensemble des conditions expérimentales, sans se soucier des besoins du vivant. Il est ainsi possible de faire varier la composition du modèle membranaire, pour être plus ou moins proche de la membrane cellulaire. Des protéines membranaires peuvent être insérées dans le modèle membranaire, afin de suivre en temps réel l’adhésion par interaction spécifique avec une protéine. Les principaux effets des NPs sur les lipides membranaires peuvent être mis en évidence par QCM-D, en changeant de modèle lipidique ou le design de l’expérience. Il est également possible de détecter des effets des NPs sur les cellules directement, et ainsi de regarder l’impact de l’exposition des cellules statiques ou en circulation du milieu de culture en présence de NPs. Des interactions spécifiques ou non spécifiques peuvent également être étudiées.

NPs d’analogues de bleu de Prusse (ABP)

L’utilisation de ces méthodes et modèles avec les NPs d’ABP pourraient permettre de valider ces méthodes pour étudier l’interface NPs membranes. Cela permettrait également de mettre en évidence l’impact de la forme sur l’interface NPs membranes. Des études par modélisation ont montré que lorsque les NPs possèdent des surfaces planes, celles-ci passent plus facilement les membranes cellulaires (Nangia and Sureshkumar, 2012). En revanche, l’internalisation est limitée lorsque l’aire de contact entre la NP et la membrane est maximale (Nangia and Sureshkumar, 2012). Ces résultats contradictoires démontrent l’intérêt d’approfondir l’influence de la forme des NPs sur l’internalisation cellulaire. De plus, l’intérêt des NPs non sphériques a été démontré in vivo, pour éviter la captation par le SRE (Fish et al., 2015). Les NPs d’ABP recouvertes de lipides DMPC présentent une surface comparable, en composition chimique, hydrophilie et charge de surface avec les NPs sphériques de DMPC Fe3O4@MSN. Les NPs d’ABP sont de formes cuboïdes, cubiques ou polyédriques. Ces différentes formes sont susceptibles d’interagir différemment avec les membranes cellulaires, qui pourraient conduire à des mécanismes et des cinétiques d’internalisation différents.

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