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Submitted on 27 Oct 2017
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Etude des propriétés de surface de nanoparticules à
l’interface avec les fluides biologiques et les membranes
cellulaires
Estelle Rascol
To cite this version:
Délivré par l’Université de Montpellier
Préparée au sein de l’école doctorale n°168
Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
Et de l’unité de recherche
Institut Charles Gerhardt de Montpellier, UMR5253
Matériaux Avancés pour la Catalyse et la Santé
Spécialité :
Biologie Santé
Présentée par Estelle RASCOL
Soutenance prévue le vendredi 9 décembre 2016 devant le jury composé de
M. Stéphane MORNET, CR, HDR, Bordeaux Rapporteur Mme Claire WILHELM, DR, Paris Rapporteur Mme Magali GARY-BOBO, CR, HDR, Montpellier Examinatrice Mme Joulia LARIONOVA, PR, Montpellier Examinatrice M. Stéphane ROUX, PR, Besançon Examinateur
Etude des propriétés de surface de
nanoparticules à l’interface avec
2
Remerciements
Cette thèse a été réalisée à la faculté de Pharmacie de Montpellier au sein de l’équipe Matériaux Avancés pour la Catalyse et la Santé (MACS) de l’Institut Charles Gerhardt de Montpellier (ICGM). Je tiens à remercier le Professeur Jean-Marie Devoisselle, directeur de l’ICGM, de m’avoir accueillie dans son établissement ainsi que M. Didier Tichit, Directeur de recherche CNRS, et responsable de l’équipe MACS pendant ma thèse.
Je tiens à remercier les membres du jury d’avoir accepté de juger mon travail de recherche. Je remercie tout d’abords M. Stéphane Mornet et Mme Claire Wilhelm, respectivement Chargé de recherche et Directrice de recherche CNRS, d’avoir accepté d’être les rapporteurs de mes travaux de thèse. Je remercie également M. Stéphane Roux, Professeur à l’université de Franche Comté, ainsi que Mme Joulia Larionova et Mme Magali Gary-Bobo, respectivement Professeure à l’université de Montpellier et Chargée de recherche CNRS, d’avoir accepté d’examiner ma thèse.
Je remercie M. Joël Chopineau, Professeur à l’université de Nîmes, d’avoir encadré ma thèse pendant ces trois ans. Je le remercie pour la confiance qu’il m‘a accordée dès le début, me permettant de gagner en autonomie. Il m’a donné l’occasion de travailler avec des chercheurs de différents laboratoires tout au long de ma thèse, de me former sur des disciplines et des techniques bien différentes de ma formation initiale, me procurant une importante ouverture scientifique.
Parmi ces chercheurs, je remercie notamment Joséphine Lai Kee Him, Nathalie Saint, et Alexandre Chenal, que j’ai rencontré dans différentes circonstances, mais avec qui j’ai partagé des séminaires et des manips. Je remercie également Erwan Oliveiro, Véronique Richard et Franck Godiard, au sein de la plateforme de microscopie électronique. Votre disponibilité, vos conseils, et votre expertise scientifique ont contribué à l’avancement de ma thèse, et au plaisir que j’ai eu à la réaliser. Je remercie ici Rémi Veneziano et Claire Rossi, pour leurs réponses à mes diverses questions pendant ma thèse, et les travaux qu’ils ont réalisé avant moi. Merci à Claire pour ses colis de lames réguliers, me permettant de faire les manips RPS. Merci Rémi d’avoir gardé le contact avec moi depuis le MIT, et de t’être toujours rendu disponible, malgré le décalage horaire ! J’en profite pour remercier ici Isabelle Passagne, mon encadrante de master, qui m’a influencée dans mes choix d’orientation et m’a motivée pour continuer en thèse. Les conseils que tu as pu me donner pendant mon master et depuis m’ont bien aidé pendant ma thèse.
Je remercie mon équipe d’accueil du site « Pharma » de l’équipe MACS, Pradial Peralta, Christophe Dorandeu, Anne Aubert, Marie Morille, Sylvie Bégu, Philippe Legrand, et Corine Tourne-Péteilh. Vous avez été d’un grand soutien pendant ces trois ans, et êtes le socle de la bonne ambiance générale. C’était un plaisir de venir travailler à vos côtés chaque jour, et de partager un café, un repas ou quelques mots sympa. Pradial et Christophe toujours disponibles pour un dépannage express ou un mot fléché de décompression, officiellement fourni par Philippe ! Anne, Marie et Sylvie toujours aux petits soins dans les coups durs, une plaque de chocolat par-ci, un pot de Nutella par là… Et Corine, la nouvelle DJ du labo! Je remercie également les personnes de l’équipe que j’ai côtoyé en dehors de pharma, à « la galéra » ou « au bâtiment 17 ».
sur la synthèse des NPs. Merci à Magali Gary-Bobo, pour ton optimisme, tes réponses efficaces à toutes mes questions, et ton enthousiasme. Merci également à Marie Maynadier et Marcel Garcia, toujours accueillants et prêts à répondre aux questions. Je remercie également Yannick Guari, toujours plein d’idées pour faire avancer les choses. J’ai apprécié nos échanges et ton implication dans le projet. Je remercie également Clarence Charnay, et nos collègues du CEA, Cédric Pisani, Odette Prat et Jean Armengaud. La participation à ce projet m’aura donné goût au travail en équipe pluridisciplinaire.
Je remercie également les collaborateurs du projet « bleu de Prusse ». Je remercie en particulier Guillaume Maurin, qui a fait toutes les synthèses du projet, et avec qui j’ai beaucoup échangé au cours de ces deux dernières années. Je remercie Jérôme Long et Joulia Larionova, pour leur implication dans le projet, et la qualité de nos échanges aux diverses réunions. Je remercie également Muriel Busson et Samuel Sevestre.
Je continue avec les copains de thèse, en « Pharma » les thésards, étudiants, et post-doc avec qui j’ai partagé les meilleurs moments : Sophie, Hinda, Gilou, Chouchou, Emilie, Saad, Antigoni, Ellie, Alexis, Aurélia, Taher, Mohammed, et j’en passe. J’ai également apprécié les autres étudiants de l’ICGM, avec qui on a partagé Laser game, futsal ou canoë, ainsi que les fameuses soirées RTT (Rat’ta thèse vous aurez compris le jeu de mot) que l’on a mis en place pour rapprocher les étudiants de l’ICGM répartis sur différents labos.
Je remercie tout particulièrement Sophie, la perle rare (ou plutôt le Raisin rare), avec qui tout a commencé par un « j’ai besoin d’assistance ». Arrivée au labo un peu avant moi, on s’est entendues dès la première semaine, on a tout partagé (la thèse, le sport, les sorties, le CU, Pint of science, la poisse, le Big Mama…) et on s’est soutenues jusqu’au bout. Même en vacances studieuses/sportives avec Chouchou et Saad ! Promis je viendrai en Rhônes Alpes te sortir des expressions saugrenues et partager une tartiflette ou un swing !
On a rencontré Gilou avant même qu’il commence sa thèse, et on a direct accroché aussi. Merci d’avoir supporté ma musique, mes bavardages, ou allers-retours incessants dans ton bureau pendant deux ans ! On s’est défoulés à l’escalade, on a partagé des supers moments avec ta bande de potes et j’ai pas mal squatté à la maison pour un couscous géant, un ping -pong ou une partie d’échec. Où que tu ailles après, je viendrai te voir aussi, promis!
Hinda, Sophie et Gilou, merci pour votre humour déjanté, votre pouvoir d’auto dérision, on s’est bien trouvés ! Vous êtes des amis génialissimes!
J’en profite pour rendre hommage à mon ami Julien, qui nous a quittés il y a quelque mois, et avec qui j’ai aussi partagé de grands moments de bonheur.
4
Table des matières
TABLE DES ILLUSTRATIONS ... 9
LISTE DES TABLEAUX ... 12
LISTE DES ABREVIATIONS ... 13
INTRODUCTION GENERALE ... 16
I. NANOMEDECINE ... 17
A. PROPRIETES PHYSIQUES ... 17
B. PROPRIETES CHIMIQUES ... 19
C. PROPRIETES BIOLOGIQUES ... 19
II. EVALUATION DE LA SECURITE BIOLOGIQUE DES NPS ... 21
A. HEMOCOMPATIBILITE ... 21
Hémolyse ... 22
Activation du complément ... 22
Coagulation, thrombose ... 23
B. PHARMACOCINETIQUE ET BIOCOMPATIBILITE DES NPS FE3O4@MSN ... 23
C. BIOCOMPATIBILITE DES NPS D’ANALOGUES DE BLEU DE PRUSSE ... 24
D. METHODOLOGIE SPECIFIQUE AUX NANOTECHNOLOGIES ... 26
III. TRAVAUX REALISES DANS CETTE THESE ... 26
A. NANOPARTICULES DE SILICE MESOPOREUSE AVEC UN CŒUR MAGNETIQUE... 27
B. NANOPARTICULES D’ANALOGUES DE BLEU DE PRUSSE ... 28
MATERIELS ET METHODES ... 31
I. PRODUITS CHIMIQUES, BIOLOGIQUES, SUBSTRATS ET REACTIFS ... 32
A. LES PRODUITS CHIMIQUES : ... 32
B. LES LIPIDES : ... 32
C. LES SURFACES : ... 33
Supports d’or pour le suivi d’interaction par résonance plasmonique de surface (RPS) ... 33
Les surfaces pour les mesures par QCM-D ... 33
D. TAMPONS ET MILIEUX : ... 34
A. NANOPARTICULES FE3O4@MSN ... 34
Synthèse des nanocristaux magnétiques (NCM) ... 34
Synthèse des NPs cœurs@coquille Fe3O4@MSN ... 35
Synthèse des PEG Fe3O4@MSN ... 37
B. NANOPARTICULES D’ANALOGUES DE BLEU DE PRUSSE ... 37
NPs NiFe : K+/Ni2+/[FeII(CN)6]3- ... 38
NPs BP: Na+/Fe3+/[FeII(CN) 6]4- ... 38
NPs Au@BP : Au@Na+/Ni2+/[FeII(CN) 6]3-@Na+/Fe3+/[FeII(CN)6]4- ... 38
C. FORMATION DES LIPOSOMES ... 39
Formation d’un film lipidique ... 39
Formation des SUV (petites vésicules unilamellaires) ... 39
Recouvrement lipidique des NPs ... 39
III. METHODES DE CARACTERISATION ... 40
A. MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A TRANSMISSION (MET) ... 40
MET ... 41
MET cryogénique (CryoMET) ... 41
MET à balayage (STEM) ... 41
B. DIFFUSION DYNAMIQUE DE LA LUMIERE ... 41
Diamètre hydrodynamique ... 42
Potentiel zêta ... 43
C. ADSORPTION-DESORPTION D’AZOTE ... 44
D. ANALYSES THERMIQUES ... 45
E. METHODES SPECTROSCOPIQUES ... 46
F. MAGNETISME ... 46
IV. METHODES DE SUIVI D’INTERACTIONS NPS-MODELES MEMBRANAIRES ... 47
A. RESONANCE PLASMONIQUE DE SURFACE (RPS) ... 47
Principe de la résonance plasmonique de surface ... 47
Description du système RPS utilisé ... 48
Montage expérimental... 49
Formation d’une bicouche lipidique ... 49
Interaction des NPs avec la bicouche lipidique ... 51
Analyse des données ... 51
B. MICROBALANCE A QUARTZ AVEC SUIVI DE LA DISSIPATION ... 52
Principe de la QCM-D ... 52
Formation d’une bicouche lipidique sur surface SiO2 ... 54
6
V. EFFETS CELLULAIRES ... 56
A. LIGNEE CELLULAIRE ... 56
B. VIABILITE CELLULAIRESUITE A L’EXPOSITION AUX NPS ... 57
C. SUIVI D’INTERNALISATIONDES NPS PAR LES CELLULES ... 58
RESULTATS ET DISCUSSION ... 59
I. SYNTHESE DES NANOPARTICULES ... 60
A. INTRODUCTION... 60
Nanoparticules cœurs-coquille ... 60
Synthèse des Fe3O4@MSN par voie sol-gel ... 61
Synthèse de NPs cœur-coquilles en vue d’applications biomédicales ... 64
B. SYNTHESE DE NPS DE FE3O4@MSN ... 65
Synthèse des cœurs magnétiques de Fe3O4 (NCM) ... 65
Injection des NCM dans la solution micellaire de CTAB ... 67
Ajout du TEOS ... 69
Purification des NPs Fe3O4@MSN ... 70
Lavage des NPs ... 70
C. DISCUSSION ... 72
II. CARACTERISATION ET FONCTIONNALISATION DES NANOPARTICULES ... 76
A. INTRODUCTION... 76
Propriétés des NPs en suspension dans les milieux biologiques ... 76
Fonctionnalisations de surface ... 79
Ciblage passif des NPs par recouvrement lipidique ... 81
B. CARACTERISATION ET FONCTIONNALISATION DES FE3O4@MSN ... 86
Caractérisations des Fe3O4@MSN natives ... 86
Caractérisation du greffage de PEG ... 88
Fonctionnalisation par recouvrement lipidique ... 93
Caractérisation du recouvrement lipidique ... 96
Dispersion et stabilité dans différents milieux ... 99
C. CARACTERISATION ET FONCTIONNALISATION DES NPS D’ANALOGUES DE BLEU DE PRUSSE ... 101
Caractérisation des NPs natives de FeNi, Au@BP et BP ... 101
Fonctionnalisation par recouvrement lipidique des NPs ... 102
Caractérisation du recouvrement lipidique ... 106
D. DISCUSSION ... 107
Caractérisation physicochimique des NPs Fe3O4@MSN ... 107
Recouvrement lipidique des NPs d’analogues de bleu de Prusse ... 111
Stabilité des NPs en suspension ... 112
III. EFFETS CELLULAIRES ... 115
A. INTRODUCTION... 115
Biocompatibilité des MSN ... 115
Design de la surface des NPs de silice ... 117
Approche spécifique à l’évaluation de la toxicité des NPs ... 119
B. RESULTATS ... 121
Viabilité cellulaire ... 121
Internalisation cellulaire... 122
C. DISCUSSION ... 128
Cinétique d’internalisation et toxicité cellulaire ... 128
Influence de la stabilité en suspension ... 130
Influence de la chimie de surface ... 131
IV. INTERACTIONS AVEC DES MODELES DE MEMBRANE ... 133
A. INTRODUCTION... 133
Interface entre les NPs et les milieux biologiques ... 133
La microbalance à quartz QCM-D : un outil de caractérisation à l’échelle nanométrique ... 134
Suivi d’interaction de NPs avec des bicouches lipidiques ... 136
B. RESULTATS ... 137
Suivi par QCM-D et RPS du dépôt des NPs sur les membranes modèles ... 138
Description du dépôt des NPs sur un modèle membranaire en QCM-D, indépendamment des modèles mathématiques ... 141
Interaction des NPs avec les membranes modèles en présence de protéines ... 145
C. DISCUSSION ... 147
Dépôt des NPs sur les modèles membranaires ... 148
Hydratation et point de contact des NPs avec les modèles membranaires ... 149
Prédictibilité de l’interaction des NPs avec les membranes cellulaires ... 152
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES ... 154
I. DISCUSSION GENERALE ... 155
A. RECOUVREMENT LIPIDIQUE DES NPS ... 155
B. INFLUENCE DE LA NATURE DE LA SURFACE SUR L’INTERFACE NPS-MEMBRANES ... 157
Fe3O4@MSNnatives ... 157
PEG-Fe3O4@MSN ... 158
8
C. INTERACTION DES NPS AVEC LES MEMBRANES CELLULAIRES : APPORT DES MODELES MEMBRANAIRES ... 161
II. PERSPECTIVES ... 162
A. COMPREHENSION DE L’INTERFACE NPS-MEMBRANES... 162
Autres tests d’interaction avec les modèles membranaires ... 162
NPs d’analogues de bleu de Prusse (ABP) ... 165
B. EVALUATION DES EFFETS BIOLOGIQUES IN VIVO ... 166
NPs Fe3O4@MSN ... 166
NPs analogues de bleu de Prusse ... 166
III. CONTRIBUTION DE CES TRAVAUX DE RECHERCHE ... 167
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 171
ANNEXES ... 188
I. REVUE NANOSCALE, 2016 ... 189
Table des illustrations
Figure 1 : Différents types de NPs développés pour des applications biologiques... 20
Figure 2 : Protocole de synthèse des NPs Fe3O4@MSN. ... 36
Figure 3 : Greffage du PEG sur les NPs Fe3O4@MSN. ... 37
Figure 4 : Recouvrement lipidique des NPs Fe3O4@MSN. ... 39
Figure 5 : Principe des mesures RPS en configuration de Kretschmann. ... 48
Figure 6 : Configuration du système de suivi d’interaction par RPS en configuration de Kretschmann. ... 48
Figure 7 : Formation d'une bicouche lipidique à la surface d’or en RPS. ... 50
Figure 8 : Protocole d'interaction des NPs avec la bicouche lipidique formée en RPS. ... 51
Figure 9 : Principe de la QCM-D. ... 53
Figure 10 : Formation d'une bicouche lipidique en QCM-D. ... 54
Figure 11 : Protocoles d’interaction des NPs avec le modèle de SLB en QCM-D. ... 55
Figure 12 : Réaction de réduction du sel de tétrazolium (MTT) en cristaux de formazan. ... 57
Figure 13 : Clichés MET des NPs synthétisées. ... 65
Figure 14 : Cliché MET des NCM synthétisés. ... 66
Figure 15 : Thermogramme ATG de la décomposition thermique des NCM après évaporation du chloroforme. ... 66
Figure 16 : Schéma de l'évolution de la réaction sol-gel en fonction de la concentration et du temps. ... 69
Figure 17 : Clichés MET des culots obtenus à chaque étape de centrifugations séparatives des NPs après synthèse. ... 70
Figure 18 : Spectres infrarouge obtenus pour 5 lots différents. ... 71
Figure 19 : Spectres infrarouge de NPs après deux lavages intensifs successifs. ... 72
Figure 20 : Schéma représentant les points-clés optimisés de la synthèse. ... 73
Figure 21 : Cliché MET des a) NCM et b) NPs natives Fe3O4@MSN. ... 86
Figure 22 : propriétés texturales des NPs. ... 87
Figure 23 : Mesures de SQUID. ... 88
Figure 24 : Caractérisation qualitative de la présence du PEG avant et après calcination, par spectroscopie infrarouge... 89
Figure 25 : Caractérisation qualitative du greffage du PEG par spectroscopie infrarouge. ... 90
10 Figure 27 : Caractérisation qualitative et quantitative du greffage du PEG sur les MSN, par analyse
thermique. ... 92
Figure 28 : Isothermes d’adsorption et désorption d’azote des Fe3O4@MSN natives et PEG-Fe3O4@MSN. ... 93
Figure 29 : analyse STEM des Fe3O4@MSN natives et DMPC-Fe3O4@MSN. ... 97
Figure 30 : Images cryoMET des NPs DMPC Fe3O4@MSN. ... 98
Figure 31 : Caractérisation physico-chimique des NPs natives, ou fonctionnalisées... 99
Figure 32 : Image MET des NPs d’analogues de bleu de Prusse. ... 101
Figure 33 : Caractérisation physico-chimique des NPs recouvertes de lipides. ... 102
Figure 34 : Caractérisation physico-chimique des NPs remises en suspension après lyophilisation. . 103
Figure 35 : Caractérisation physico-chimique des 3 types de NPs d’analogues de bleu de Prusse recouvertes de lipide DMPC. ... 105
Figure 36 : Images cryoMET des NPs BP et Au@BP après recouvrement lipidique par des liposomes de DMPC. ... 106
Figure 37 : Observation des NPs BP et Au@BP après recouvrement lipidique par les lipides DMPC par la technique de STEM. ... 107
Figure 38 : Principaux paramètres influençant le recouvrement des NPs par des lipides. ... 110
Figure 39 : Proposition de mécanisme pour la fusion des liposomes à la surface des NPs d’analogue de bleu de Prusse. ... 112
Figure 40 : Evaluation de l’activité mitochondriale des cellules HepG2 par le test MTT après exposition aux NPs. ... 121
Figure 41 : Observation au MET d’une coupe de cellules HepG2 après exposition aux Fe3O4@MSN natives pendant 3h. ... 122
Figure 42 : Observation au MET d’une coupe de cellules HepG2 après exposition aux Fe3O4@MSN natives pendant 6h. ... 123
Figure 43 : Observation au MET d’une coupe de cellules HepG2 après exposition aux Fe3O4@MSN natives pendant 24 h. ... 123
Figure 44 : Observation au MET d’une coupe de cellules HepG2 après exposition aux PEG-Fe3O4@MSN pendant 3h. ... 124
Figure 45 : Observation au MET d’une coupe de cellules HepG2 après exposition aux PEG-Fe3O4@MSN pendant 6h. ... 125
Figure 46 : Observation au MET d’une coupe de cellules HepG2 après exposition aux PEG-Fe3O4@MSN pendant 24h. ... 125
Figure 48 : Observation au MET d’une coupe de cellules HepG2 après exposition aux DMPC-Fe3O4@MSN pendant 6h. ... 127
Figure 49 : Observation au MET d’une coupe de cellules HepG2 après exposition aux DMPC-Fe3O4@MSN pendant 24h. ... 127
Figure 50 : Enregistrement en temps réel de l’impédance cellulaire pendant l’incubation des cellules HepG2 avec les NPs. ... 130 Figure 51 : Suivi de l’interaction des NPs avec une SLB par mesure de la variation de fréquence f7/7 et
de la dissipation D7 par QCM-D. ... 138
Figure 52 : Suivi de l’interaction des NPs avec une tBLM par mesure de la réflectivité en RPS. ... 140 Figure 53 : Vitesse de dépôt des NPs en fonction de la force ionique et de la "concentration". ... 142 Figure 54 : Rapport -ΔD7/(Δf7/7) des trois types de NPs en fonction de la force ionique et de la "concentration" (en Hz-1)... 144
Figure 55 : Suivi de l’interaction des NPs avec une SLB en présence de protéines dans le milieu, par mesure de la variation de fréquence f7/7 et de la dissipation D7 par QCM-D. ... 146
Figure 56 : Variation de dissipation en fonction de la variation de fréquence, à partir du 7éme
harmonique du protocole 3 (diagramme ΔD7 – Δf7/7). ... 147
12
Liste des tableaux
Tableau 1 : Caractéristiques des différents lipides utilisés. ... 32
Tableau 2 : Revue bibliographique des voies de synthèse des NPs cœur-coquilles Fe3O4@MSN. ... 63
Tableau 3 : Calcul de l’équivalence micellaire CTAB/NCM Fe3O4. ... 67
Tableau 4 : Quantification des résidus de matière organique obtenue par analyse élémentaire. ... 71
Tableau 5 : Impact des caractéristiques physicochimiques sur le comportement des NPs en milieu biologique. ... 79
Tableau 6 : Bandes caractéristiques des vibrations des groupements du PEG en infrarouge et en Raman (Catauro et al., 2015; Jung et al., 2005). ... 91
Tableau 7 : Caractérisation physico-chimique des vésicules lipidiques composées de EPC, DMPC, DPPC, DOTAP, et DOTAP 10% DMPC 90% en tampon HBS 150 mM (Hepes 20 mM, pH 7,4). ... 93
Tableau 8 : Caractérisation physico-chimique des NPs recouvertes EPC, DMPC, DPPC, DOTAP, et DOTAP 10% DMPC 90% en tampon HBS 150 mM (Hepes 20 mM, pH 7,4). ... 94
Tableau 9 : Caractérisation physico-chimique des NPs recouvertes par les lipides DMPC et DPPC en tampon HBS 150 mM (Hepes 20 mM, pH 7,4). ... 95
Tableau 10 : Caractérisation physico-chimique des NPs recouvertes par les lipides DMPC et DPPC en tampon HBS 5 mM (Hepes 20 mM, pH 7,4). ... 95
Liste des abréviations
ABP : analogues de bleu de Prusse (FeNi, BP, Au@BP) ATG : analyse thermogravimétrique
ATR : réflexion totale atténuée
Au@BP : NPs cœur d’or et coquille de bleu de Prusse NPs de formule Au@Na+/Ni2+/[FeII(CN) 6]
3-@Na+/Fe3+/[FeII(CN) 6]
4-BET Brunauer–Emmett–Teller BJH : Barrett–Joyner–Halenda BHE : barrière hémato-encéphalique
BP : bleu de Prusse, polymère de coordination de formule Na+/Fe3+/[FeII(CN) 6]
4-CARPA : « complement activation-related pseudo-allergy » CD : carbon nanodots
CI 50 : concentration inhibant 50 % des cellules CMC : concentration micellaire critique
CryoMET : microscopie électronique à transmission cryogénique CTAB : bromure de cetyltrimethylammonium
DSC : calorimétrie différentielle à balayage DLS : diffusion dynamique de la lumière
DLVO : théorie de Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeak DMPC : 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
DMPC-Fe3O4@MSN : nanoparticules « cœur-coquille » Fe3O4@MSN fonctionnalisées avec une
bicouche lipidique composée de lipides DMPC DMSO : diméthylsulfoxyde
DOPC : 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DOTAP : 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane DPPC : 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DRX : diffraction des rayons X
DSPE-PEG-SPA : 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine - polyethylene glycol 2000 - succinimidyl propionate
EE : efficacité d’encapsulation EPC : L-α-phosphatidylcholine ERO : espèces réactives de l’oxygène
14 FDA : “food and drug administration” agence de sécurité alimentaire et du médicament américaine FEM : méthode des éléments finis
Fe3O4@MSN : NPs « cœur-coquille », avec un nanocristal d’oxyde de fer au cœur et une coquille de
silice mésoporeuse
FeNi : polymère de coordination K+/Ni2+/[FeII(CN) 6]
3-GRAS : “generally recognized as safe” généralement considéré comme non toxique HBS : « Hepes buffered saline », tampon Hepes 20 mM (NaCl 5 ou 150 mM), pH 7,4 HSA : albumine de sérum humain
IRM : imagerie par résonance magnétique IV : intraveineuse
LSPR : résonnance plasmonique de surface localisée MET : microscopie électronique à transmission MSN : nanoparticules de silice mésoporeuse
MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide NCM : nanocristaux magnétiques NPs : nanoparticules NTC : nanotubes de carbone OG : oxyde de graphène PA : principe actif
PBS : « Phosphate Buffered Saline”, tampon phosphate de composition KH2PO4 1,5 mM,
Na2HPO4.7H2O 8,0 mM, KCl 3 mM, NaCl 138 mM, pH 7,4
PDI : indice de polydispersité PEG : polyéthylène glycol
PEG -Fe3O4@MSN : nanoparticules « cœur-coquille » Fe3O4@MSN fonctionnalisées en surface avec
des groupements polyéthylène glycol PLGA : acide poly (D,L-lactico-glycolique) PLL : poly-L-lysine
PSD : distribution du diamètre des pores PZ : potentiel zêta
QCM-D : microbalance à quartz avec suivi de la dissipation QD : « quantum dots », points quantiques
RPS : résonnance plasmonique de surface SDS : sodium dodecyl sulfate
SRE : système réticulo-endothélial
STEM : microscopie électronique à transmission à balayage
SUV : « small unilamellar vesicles », petites vésicules unilamellaires SVF : sérum de veau fœtal
TA : température ambiante
tBLM : « tethered lipid bilayer », bicouche lipidique ancrée TEOS : tétraéthylorthosilicate
Tm : température de transition
I.
Nanomédecine
Les applications des nanotechnologies au domaine médical ont permis des avancées intéressantes ces dernières années. Les nanoparticules (NPs), définies comme des objets dont au moins une dimension est inférieure à 100 nm (Garnett and Kallinteri, 2006), sont de l’ordre de grandeur des virus, des protéines ou encore de certains organites cellulaires. De nombreuses applications en santé ont été développées à partir des NPs : pour améliorer les techniques de diagnostic in vitro, in vivo, en imagerie, ou en médecine régénérative (Boisseau and Loubaton, 2011). Selon leurs propriétés physicochimiques, les NPs ont la capacité de passer certaines barrières biologiques et de se distribuer dans l’organisme (Rocks and Dawson, 2014). Les NPs ont été particulièrement développées en santé pour transporter des principes actifs (PA), jusqu’à la cible biologique (tissus, organe, cellules) (Lammers et al., 2011). Les NPs ont généralement tendance à être captées par le système réticulo-endothélial (SRE), qui est donc la cible des NPs de première génération (Ehmann et al., 2013). Les NPs de seconde génération ont été modifiées afin d’éviter la captation au niveau du SRE, et allonger ainsi leur temps de circulation dans l’organisme (Ehmann et al., 2013). Les NPs de troisième génération sont développées pour cibler spécifiquement un organe ou un type cellulaire (Dawidczyk et al., 2014). Il est également possible de contrôler la libération du PA, lorsque le vecteur est distribué au niveau de la cible (Petros and De Simone, 2010; Schutz et al., 2013). Ce sont les NPs de 4ème génération. Les
générations de NPs ont été développées au fur et à mesure de la découverte des propriétés physiques, chimiques et biologiques des NPs.
A. Propriétés physiques
L’augmentation du rapport surface/volume confère aux nanomatériaux de nouvelles propriétés physiques. Les propriétés optiques, magnétiques, électroniques ou encore plasmoniques sont mises en évidence pour les NPs métalliques.
18 est en essai pré-clinique (Auritol®) et une spécialité est approuvée en diagnostic in vitro (Verigene® platform) (Schutz et al., 2013).
De nouvelles propriétés optiques apparaissent également pour certains métaux semi-conducteurs. Les propriétés électroniques de ces matériaux conduisent à une délocalisation des électrons sous l’effet d’une excitation lumineuse (Alivisatos, 1996). Cette délocalisation électronique induit des propriétés de luminescence très localisée, on parle alors de points quantiques ou « quantums dots » (QD). Afin de confiner au maximum la délocalisation électronique au sein de la particule, une passivation est généralement nécessaire afin qu’il n’y ait pas d’échange d’énergie avec le milieu extérieur. Cette passivation est réalisée par l’addition en surface d’une fine couche d’un métal semi-conducteur. La taille des particules va influencer la délocalisation électronique, donc les propriétés luminescentes dépendent de la taille des QD. Les QD les plus fréquemment étudiés pour des applications biologiques sont des nanocristaux de CdSe, avec une couche de passivation de ZnS (Medintz et al., 2005). Un nanocristal de CdSe émet sur une large partie du spectre du visible (de 610 à 510 nm) en faisant varier la taille des QD, allant du rouge (200 Å) au vert (20 Å). La bande d’émission est très étroite (15 - 20 nm) (Alivisatos, 1996). En biologie, un intérêt supplémentaire des QD est la possibilité d’excitation dans l’infrarouge, ce qui permet d’une part d’atteindre des tissus profonds, et d’autre part d’éviter les phénomènes d’autofluorescence in vivo (Medintz et al., 2005). Les applications en biologie sont multiples, allant du marquage cellulaire à la détection in vivo, permettant de suivre les particules mais également de développer des systèmes de diagnostic (Michalet et al., 2005). Le développement en clinique de ces NPs est cependant limité par leur toxicité (Hardman, 2006) (fig. 1).
Des propriétés photoluminescentes ont également été mises en évidence pour des NPs de silicium poreux (Ding et al., 2015) et de carbone (« Carbon nanodots », CD) (Miao et al., 2015) à l’échelle nanométrique. Ces NPs présentent l’avantage d’être moins toxiques que les QD, et sont facilement fonctionnalisables en surface. Les CD présentent une photoluminescence intense dans le spectre du visible, sont facilement dispersées dans l’eau, et ont une bonne résistance au photoblanchiment (Miao et al., 2015). Les nanomatériaux à base de carbone, tels que les nanotubes de carbone présentent également des propriétés intéressantes en termes de rigidité et de conduction électrique (Gangopadhyay and De, 2000; Nayak et al., 2011).
particules monodomaines peuvent être suivies à distance en imagerie par résonance magnétique (IRM), sous l’effet d’un champ magnétique (Corot et al., 2006). De nombreuses spécialités pharmaceutiques composées de nanocristaux d’oxyde de fer superparamagnétiques (SPION) sont sur le marché ou en essai clinique, principalement pour des applications en IRM (Schutz et al., 2013).
B. Propriétés chimiques
Les propriétés chimiques des métaux ou des oxydes métalliques sont également intéressantes pour des applications en santé, pour des réactions d’oxydo-réduction ou de catalyse localisées. Les propriétés catalytiques des métaux sont ainsi plus importantes sous la forme de NPs (métaux Pt, Pd, Cu) (Jin, 2012). Les propriétés photocatalytiques des oxydes métalliques sont particulièrement impactées, la surface de matière exposée aux rayons étant beaucoup plus importante. En raison des formes cristallines variées du TiO2 (rutile, anatase, brookite etc), de nombreuses applications reposent
sur le développement des NPs de TiO2 (Macwan et al., 2011; Nakamura et al., 2000).
A côté des NPs « rigides », mises en avant pour leurs propriétés physiques, des NPs “souples” sont développées pour leurs propriétés chimiques (fig. 1). Ces assemblages moléculaires sont des dendrimères, des micelles, des NPs polymériques (Nayak and Lyon, 2005). Ces assemblages permettent d’une part de contrôler la forme, la charge, la composition, l’hydrophilie de la surface, et d’autre part d’encapsuler des principes actifs (PA) (Rao and Geckeler, 2011). Des assemblages sont également formés de molécules d’origine biologique, telles que des polymères ou des dendrimères d’acide aminés (lysines ou histidines) (Brevet et al., 2014; Goncalves et al., 2002), ou des lipides. Les liposomes et les nanocapsules lipidiques en particulier, sont de bons vecteurs de molécules hydrophobes (Huynh et al., 2009).
La libération des PA peut ensuite être contrôlée par différents stimuli physiques ou chimiques (Liu et al., 2015b) : changement de pH (Liu et al., 2015c) dans le milieu extracellulaire des tumeurs ou dans les endosomes, en réponse à un changement de température (Liu et al., 2014a), libération en présence d’une protéine comme le glutathion (Han et al., 2015; Roggers et al., 2012), changement de pression osmotique, champ magnétique (Lee et al., 2015), ultrasons (Boissenot et al., 2016; Mo et al., 2012) ou faisceau lumineux (Liu et al., 2015a).
C. Propriétés biologiques
20 vaisseaux formés rapidement (néovascularisation) présentent des fenestrations permettant le passage des NPs à travers l’endothélium incomplet (Brigger et al., 2002). Les tissus tumoraux étant dépourvus de système lymphatique, les NPs ne sont pas épurées de la tumeur et peuvent s’y accumuler (Merian et al., 2012). Ce phénomène, appelé effet de perméabilisation et de rétention augmenté (EPR) a été décrit pour la première fois en 1986 par Maeda et Matsumura et confirmé chez l’homme en 1995 (Gabizon et al., 1994). L’effet EPR permettrait de cibler passivement les tumeurs en utilisant des NPs (Chauhan et al., 2012; Lazarovits et al., 2015; Matsumura and Maeda, 1986).
En fonction de leurs propriétés physicochimiques, telles que le ratio hydrophile / hydrophobe, la stabilité en suspension, la charge de surface, la forme ou la taille, d’autres barrières biologiques peuvent être franchies par les NPs (Lammers et al., 2011; Petros and De Simone, 2010; Sonavane et al., 2008). Ainsi, des petites NPs hydrophobes telles que des NPs d’or ou des nanocapsules lipidiques ont été décrites comme pouvant passer la barrière hémato encéphalique (BHE) et transporter des principes actifs au cerveau (Aparicio-Blanco et al., 2016; Beduneau et al., 2008) (fig. 1).
Au contact des fluides biologiques, la formation d’une couronne de protéines à la surface des NPs a pour conséquences : la captation rapide des NPs par le système réticulo-endothélial (SRE) par le biais des opsonines et l’activation du système immunitaire par activation de la cascade du complément (Aggarwal et al., 2009; Dobrovolskaia et al., 2016). Les NPs sont captées par les macrophages, au niveau du foie et de la rate principalement, qui sont les premiers organes à capter les NPs. Cette propriété présente un intérêt pour améliorer l’efficacité des vaccins (Herzog et al., 2009), en augmentant la réponse immunitaire. Par contre, ce phénomène est également à l’origine d’effets toxiques (Westmeier et al., 2015), par l’induction de réactions d’hypersensibilité ou d’inflammation (Dobrovolskaia et al., 2008; Dobrovolskaia et al., 2016; Ilinskaya and Dobrovolskaia, 2016).
Les NPs rigides, composées de métaux, d’oxydes métalliques, ou de carbone présentent des propriétés optiques, électriques, catalytiques intéressantes. Ces propriétés sont associées à leur petite taille et à leur réactivité de surface, et induisent également des effets toxiques. Ces NPs sont hydrophobes ou chargées, généralement de taille inférieure à 50 nm, et ont tendance à s’agréger. Ces caractéristiques induisent l’adhésion des NPs aux membranes et le passage des barrières biologiques. Les NPs souples sont des assemblages macromoléculaires composés de lipides, d’acides aminés ou de polymères. Ces NPs présentent généralement un diamètre supérieur à 50 nm, et leur charge de surface peut être contrôlée en fonction de la composition. Ces NPs sont donc moins toxiques et permettent généralement d’encapsuler des molécules d’intérêt thérapeutique (Huynh et al., 2009; Kermanizadeh et al., 2015; Li and Chen, 2011; Liu et al., 2015b; Rao and Geckeler, 2011; Rocks and Dawson, 2014).
Il est possible d’améliorer les propriétés d’un matériau en l’associant à un autre. Ainsi, des NPs rigides, potentiellement toxiques (Li and Chen, 2011), sont recouvertes d’un matériau biocompatible (Prakash et al., 2015). Ces NPs sont dites de type « cœur-coquille ». L’association de propriétés biologiques, chimiques et physiques sur un même nano-objet offre la possibilité de faire de l’imagerie, du diagnostic, et de la libération contrôlée de PA avec le même assemblage nanoparticulaire (Lammers et al., 2011). Dans ces travaux de thèse, deux sortes de NPs cœurs-coquilles sont étudiés, de taille, de forme et de compositions différentes : des NPs sphériques de silice mésoporeuse contenant un cœur magnétique d’oxyde de fer (Fe3O4@MSN) et des NPs d’analogues de bleu de Prusse, avec ou sans
cœur d’or (Au@BP). Les propriétés théranostiques de ces NPs, doivent permettre de suivre leur biodistribution par imagerie, de contrôler localement et temporellement l’activité thérapeutique (Lammers et al., 2011). Ces NPs sont donc développées dans le but d’améliorer le ciblage des tissus pathologiques, et réduire ainsi la toxicité des traitements vis-à-vis du reste de l’organisme. Cependant, les NPs interagissent elles-mêmes avec l’organisme, pouvant également induire des effets indésirables (De Jong and Borm, 2008).
II.
Evaluation de la sécurité biologique des NPs
Lorsque les NPs sont administrées à un organisme vivant, l’interaction des particules avec les molécules biologiques peut induire des effets toxiques (De Jong and Borm, 2008; Lammers et al., 2011). En fonction de la taille, de la forme et de la chimie de surface des NPs, il se forme une couronne de protéines autour des NPs (Fatisson et al., 2012). La présence ou non de cette couronne de protéines, ainsi que sa composition influence la réponse biologique vis-à-vis des NPs (Westmeier et al., 2015).
A.
Hémocompatibilité
22 les plaquettes, les protéines, etc (Lazarovits et al., 2015). L’interaction des NPs avec les composants du sang influence la biodistribution, la biocompatibilité et donc l’efficacité et la toxicité des NPs (Westmeier et al., 2015). Il est donc indispensable d’étudier l’hémocompatibilité des NPs.
Hémolyse
Le terme « hémolyse » désigne les dommages induits sur les érythrocytes. Les globules rouges représentent un volume important du compartiment sanguin, et sont responsables du transport de l’oxygène par l’hémoglobine. L’hémolyse peut être médiée par le système immunitaire, par le biais d’anticorps, ou non immunogène (Dobrovolskaia et al., 2008). Dans ce cas, les NPs interagissent directement avec la membrane des globules rouges. Les NPs anioniques ou neutres n’induisent pas d’hémolyse, contrairement aux NPs cationiques. Les NPs cationiques sont attirées par la membrane cellulaire chargée négativement. Cette forte interaction peut être à l’origine de la rupture de la membrane cellulaire (Dobrovolskaia et al., 2008). Les NPs de silice peuvent également induire une hémolyse, comme cela a été décrit précédemment (Slowing et al., 2009). Ce phénomène, moins important pour des NPs de silice mésoporeuse que des NPs de silice colloïdale, serait lié à la proportion de silanols en surface des NPs, ou à des forces de Van der Waals importantes entre la surface de la NP et la membrane des globules rouges (Kettiger et al., 2016; Kettiger et al., 2015).
Activation du complément
Coagulation, thrombose
Pour limiter la formation de la couronne de protéines autour des NPs et éviter l’activation du complément, certaines NPs sont modifiées en surface (Salmaso and Caliceti, 2013). Ces NPs ont tendance à être captées moins rapidement par les cellules du système réticulo-endothelial, permettant de prolonger le temps de demi-vie dans l’organisme (Salmaso and Caliceti, 2013). Le fait d’augmenter le temps de résidence des NPs dans le compartiment sanguin augmente les interactions avec les composants de la chaine de coagulation (Dobrovolskaia et al., 2008). Cela augmente les chances d’activation des plaquettes, voire de provoquer la formation d’un thrombus.
B. Pharmacocinétique et biocompatibilité des NPs Fe
3O
4@MSN
La toxicité des NPs de MSN a été étudiée in vivo, en utilisant un modèle de souris (Chen et al., 2013). Une étude de la toxicité aigüe de NPs de silice amorphe de 64 nm a été réalisée sur un modèle de souris (Yu et al., 2013). La dose létale 50, de 262,5 mg kg-1, a été déterminée par la méthode Dixon de
l’ajustement de doses. La silice a ensuite été dosée dans les organes principaux : cœur, foie, rate, poumons, reins, cerveau. 12,57 % de la silice injectée s’est accumulée dans le foie et 34,78 % est retrouvée dans la rate, 14 jours après l’injection de NPs à une dose de 177,5 mg kg-1. Les NPs sont
principalement accumulées dans les macrophages résidents de ces organes, une faible partie étant internalisée dans les hépatocytes ou les cellules endothéliales des vaisseaux de la rate ou des poumons. Les macrophages captent les NPs, ce qui induit le relargage de cytokines inflammatoires, de chimiokines, et conduit à la production de stress oxydant. L’activation des cellules de Kupffer, les macrophages du foie, induit leur propre dégradation. Les cellules de Kupffer « désintégrées » sont à leur tour absorbées par des cellules de Kupffer. Les lymphocytes et neutrophiles circulants sont recrutés. Cette réponse immunitaire innée se poursuit jusqu’à la formation d’un granulome. Lorsque les administrations de NPs sont répétées, le granulome peut ensuite évoluer en fibrose.
L’absorption, la distribution, et l’excrétion des NPs de silice mésoporeuse (MSN) de 110 nm ont été étudiées après administration à des souris par 4 voies différentes : intraveineuse, hypodermique, intramusculaire et orale (Fu et al., 2013). La toxicité aigüe des NPs après exposition par les 4 différentes voies a été évaluée. Les souris (5 souris par dose et par voie d’administration) ont été exposées à des doses allant jusqu’à 5000 mg kg-1 par voie orale, 1800 mg kg-1 par voie hypodermique,
2400 mg kg-1 par voie intramusculaire et 800 mg kg-1 par voie intraveineuse. Aucune souris n’est morte
après exposition à des doses de 50 et 500 mg kg-1 par les 4 voies d’administration. Les NPs ont ensuite
été administrées à une dose de 50 mg kg-1, et les souris ont été sacrifiées 24 h et 7 jours après
24 après administration par voie orale, par rapport aux autres voies. Elle est plus importante dans les reins après administration hypodermique, et dans les poumons après administration intraveineuse. L’effet de doses uniques et répétées de MSN creuses de 110 nm a été étudié après administration par voie intraveineuse à des souris (Liu et al., 2011b). D’après cette étude, les MSN creuses montrent une dose létale 50 supérieure à 1000 mg kg-1 en dose unique, ce qui est bien supérieur à celle déterminée
pour les NPs de silice de 64 nm (262,5 mg kg-1) (Yu et al., 2013). Les NPs ont ensuite été injectées aux
souris à des doses de 20, 40 et 80 mg kg-1, de façon répétée pendant 14 jours, par voie intraveineuse.
Ces traitements n’ont causé la mort d’aucune souris. Les souris sont sacrifiées 1 mois après la première injection, pour doser le contenu en silicium dans les organes et faire l’observation histologique et cellulaire. Aucune toxicité n’est observée suite aux administrations répétées des NPs à la dose de 20 mg kg-1, et aucune anomalie au niveau de la rate, des reins et des poumons aux doses de
40 et 80 mg kg-1 n’a été observée. En revanche, à partir de la dose de 40 mg kg-1, une infiltration
lymphocytaire et la formation de granulomes est observée au niveau du foie.
La pharmacocinétique et la biocompatibilité de NPs MSN et MSN recouvertes de lipides PEGylés ont été comparées, après injection intraveineuse à des souris (Van Schooneveld et al., 2008). Les MSN ayant un diamètre total de 34,3 nm comprennent un QD composé de Cd de 7,8 nm de diamètre. Les propriétés de fluorescence de ces NPs de type cœur-coquille permettent un suivi in vivo en temps réel. Les NPs cœur-coquille recouvertes de lipides DSPE-PEG en monocouche sont également marquées par un agent de contraste, le gadolinium, pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Le temps de circulation dans l’organisme est déterminé par imagerie par fluorescence du QD et dosage du cadmium par ICP-MS. Il est de 14 et 162 min pour les NPs natives et recouvertes de lipides respectivement, mesuré par ICP-MS, et de 18 et 165 min mesuré par fluorescence. Les résultats obtenus avec les deux méthodes sont cohérents, démontrant que les NPs restent intactes au cours de l’étude. Par contre, la biodistribution des deux types de NPs est différente, les NPs natives s’accumulent rapidement dans le foie, comme observé une heure après exposition. A 4 h et 24 h après administration, les NPs ne sont quasiment plus détectées dans le foie, et sont donc éliminées. Les NPs recouvertes de lipides PEGylés s’accumulent moins rapidement dans le foie, et montrent un temps de demi-vie plus long. Elles restent en circulation dans le sang plus longtemps que les NPs natives et sont toujours observées dans le foie 4 h et 24 h après administration, indiquant une élimination plus lente que les NPs natives (Van Schooneveld et al., 2008).
C. Biocompatibilité des NPs d’analogues de bleu de Prusse
césium ou du thallium (Thompson and Callen, 2004). La dose de radiogardase recommandée est de 9 g par jour chez l’adulte. La mise sur le marché du BP permet de connaitre le profil toxicologique de ce composé chez l’homme, et pour différentes espèces animales (Pearce, 1994). L’administration du BP à des souris, des moutons, des chiens, des ruminants ou des humains, n’a pas montré de toxicité. Cependant, les études sont majoritairement réalisées par voie orale. Le BP insoluble n’est pas absorbé par la barrière intestinale et est éliminé tel quel dans les selles (Thompson and Callen, 2004).
La toxicité du BP sous la forme de NPs a été étudiée après injection par voie intraveineuse chez la souris (Chen et al., 2016). Les NPs cubiques de BP, d’une taille de 100 nm, ont été injectées à une dose de 8 mg kg-1 à des souris. Les souris ont été sacrifiées 1 h, 6 h, 1 jour, 3 jours, 7 jours et 60 jours après
administration, pour collecter le sang, les reins, le foie, la rate et les intestins. Les souris ont survécu jusqu’à 60 jours après administration des NPs. Des symptômes légers (somnolence et perte d’appétit) apparaissent environ 1 h après administration, et disparaissent dans les 3 jours suivants. Ces symptômes sont accompagnés de l’accumulation des NPs dans le foie et la rate, qui se traduit par une coloration bleue de plus en plus intense pendant les 3 jours suivant l’administration. Les organes retrouvent peu à peu une couleur normale 7 jours après administration, conservant toujours des points bleus 60 jours après administration. L’accumulation de NPs dans les organes est associée à une atteinte des populations de lymphocytes T (cellules T CD3+CD4+ et CD3+CD8+) dans la rate et le sang. Les
constantes biochimiques sont élevées 1 h après administration, avec des concentrations sanguines de bilirubine totale de 5 U L-1, d’alanine transaminase de 120 U L-1, d’aspartate transaminase de 300 U L-1,
et de phosphatase alcaline de 220 U L-1. Ces constantes reviennent progressivement à des valeurs
normales dans les heures qui suivent l’injection. Ces NPs de 100 nm administrées par voie intraveineuse à une dose unique de 8 mg kg-1 à des souris induit une toxicité aigüe, mais sans
séquelles à long terme après l’excrétion des NPs.
Des NPs de BP de 40 nm ont été administrées par voie intraveineuse à une dose unique de 20 mg kg-1
(Liang et al., 2013b). Aucun effet n’avait été observé sur les coupes histologiques du cœur, du foie, de la rate, des poumons et des reins, 15 jours et 30 jours après administration. Cette différence peut s’expliquer par une taille plus faible ou la stabilisation des NPs en suspension par de l’acide citrique en surface. Les NPs de BP sont suivies par tomographie photoacoustique, et observées dans les vaisseaux sanguins du cerveau pendant au moins 1 h.
26
D. Méthodologie spécifique aux nanotechnologies
Les résultats des études de biocompatibilité des NPs de silice ou de BP sur un modèle de souris montrent qu’on ne peut pas conclure sur la biocompatibilité des NPs en fonction de leur composition chimique. La dose létale 50 des NPs de silice mésoporeuse de 110 nm est supérieure à 1000 mg kg-1
(Liu et al., 2011b) contre seulement 262,5 mg kg-1 pour des NPs de silice colloïdale amorphe de 63 nm
(Yu et al., 2013). Après une dose unique de 20 mg kg-1 de NPs de BP de 40 nm, aucun effet n’est
observé sur les tissus 15 et 30 jours après (Liang et al., 2013b), tandis que des NPs de 100 nm à une dose de 8 mg kg-1 sont toujours détectées dans le foie et la rate 60 jours après injection (Chen et al.,
2016). Les études de biocompatibilité ou de toxicité des NPs ne sont pas comparables entre elles, et ne donnent pas des résultats cohérents avec les résultats obtenus in vitro (Dobrovolskaia and McNeil, 2013; Han et al., 2012). Les différences d’effets relevées ici ne sont ni dose dépendants, ni temps dépendants, ni taille dépendants. Celles-ci peuvent être associées à une différence de la stabilité en suspension des particules, aux méthodes expérimentales utilisées, à la difficulté de définir correctement la « dose » (Alkilany et al., 2016; Rushton et al., 2010).
L’évaluation des effets biologiques est spécifique aux NPs (Dekkers et al., 2016). Chaque étude toxicologique doit être menée à la suite d’une étude approfondie des caractéristiques physico-chimiques des NPs étudiées, en milieu biologique (Fatisson et al., 2012; Jiang et al., 2009; Moore et al., 2015; Oberdorster et al., 2005; Rivera Gil et al., 2010). Des tests complémentaires à ceux effectués pour les études réglementaires sont généralement nécessaires pour une bonne compréhension des résultats. Ces tests impliquent des méthodes de chimie analytique (Marquis et al., 2009), des méthodes de screening haut débit et de modélisation pour obtenir les relations structure-activité (Nel et al., 2013), ou encore l’application de méthodes biophysiques (Chen and Bothun, 2013). L’utilisation de modèles membranaires peut faciliter la mise en relation des caractéristiques physico-chimiques, avec les effets in vitro et in vivo.
III. Travaux réalisés dans cette thèse
A.
Nanoparticules de silice mésoporeuse avec un cœur magnétique
Les nanoparticules de silice peuvent être formées de silice cristalline, de silice colloïdale, de silice mésoporeuse ou encore de silicium (Nafisi et al., 2014). La silice amorphe, est très répandue dans l’environnement et n’est pas toxique par rapport à la silice cristalline. Afin d’augmenter l’aire de surface spécifique des NPs de silice, des nanoparticules de silice amorphes peuvent être synthétisées avec une porosité, c’est le cas les nanoparticules de silice mésoporeuse (MSN) de type MCM-41. Les MSN sont parmi les NPs rigides les plus étudiées comme vecteur pour le traitement du cancer. La silice mésoporeuse est reconnue comme non toxique (GRAS « Generally recognized as safe ») par la FDA. Il est possible d’encapsuler un grand nombre de molécules dans les pores (Ashley et al., 2011). La libération des PA encapsulés peut être contrôlée par divers stimuli externes : thermiques, magnétiques ou par changement de pH (Song and Yang, 2015). D’autre part, au cours de la synthèse, il est possible d’ajouter des molécules qui sont alors intégrées à la structure silicique. La surface des MSN présente des groupements silanols et siloxanes. Selon le degré d’hydroxylation de la surface, la proportion de groupes silanols augmente (Rimola et al., 2013). La présence de ces groupes silanols permet de lier différentes molécules de façon covalente, et fonctionnaliser ainsi la surface avec des groupements chimiques ou des molécules biologiques dans un but de ciblage cellulaire. Les MSN représentent donc une plateforme intéressante pour transporter des PA, pour les protéger de l’environnement extérieur ou en limiter la toxicité, et pour cibler activement un tissu pathologique. Pendant la synthèse des NPs, il est possible non seulement d’ajouter des molécules d’intérêt, mais aussi des NPs plus petites. Des quantum dots (Van Schooneveld et al., 2008), des grains d’or (Veneziano et al., 2012), des grains de cuivre (Derrien et al., 2008) ou des nanocristaux magnétiques (Kim et al., 2008) peuvent ainsi être intégrés à l’intérieur des MSN. C’est un moyen de réduire la toxicité de ces petites NPs dont la réactivité est importante, tout en mettant à profit leurs propriétés particulières. Les propriétés magnétiques apportées par les nanocristaux de magnétite permettent d’une part de suivre les NPs dans l’organisme par IRM (Lee et al., 2015), et d’autre part de produire localement de la chaleur par hyperthermie (Patil et al., 2016). Cela permet donc d’associer de l’imagerie, du diagnostic et une activité thérapeutique sur le même objet. Les Fe3O4@MSN représentent donc une plateforme théranostique, pouvant permettre la circulation dans
l’organisme, associé à un suivi par imagerie, l’encapsulation de molécules thérapeutiques libérées au niveau de la cible cellulaire.
Dans ces travaux de thèse, la synthèse de NPs de silice mésoporeuse Fe3O4@MSN de forme sphérique
28 Ces NPs cœurs-coquilles ont ensuite été fonctionnalisées en surface par greffage de groupements PEG ou recouvrement d’une bicouche lipidique. Le greffage de groupements PEG a été choisi pour rendre la surface des Fe3O4@MSN hydrophile. Le recouvrement des Fe3O4@MSN par des bicouches lipidiques
rend la surface plus lipophile. Le recouvrement lipidique des Fe3O4@MSN a été réalisé dans
différentes conditions, en faisant varier la température, la force ionique du tampon et la composition lipidique des vésicules. Les Fe3O4@MSN natives et fonctionnalisées de PEG ou de DMPC ont été
dispersées dans des milieux de forces ioniques différentes, en présence ou non de protéines. L’influence de la chimie de surface des NPs sur la dispersion et la stabilité en suspension a été étudiée dans ces milieux.
Les effets cytotoxiques des Fe3O4@MSN ont été évalués in vitro sur une lignée de cellules
d’hépato-carcinome humain HepG2. La viabilité cellulaire a été évaluée par le test MTT, et comparée aux résultats obtenus par suivi d’impédance cellulaire. Cette technique sans fluorochrome permet de s’affranchir des risques d’interférences observés entre les NPs et certains tests. L’internalisation et la localisation sub-cellulaire des Fe3O4@MSN natives et fonctionnalisées de PEG ou de DMPC ont été
observées par microscopie électronique à transmission. Les observations ont été réalisées après différents temps d’incubation avec les NPs, en présence de protéines de sérum de veau fœtal (SVF) 10% dans le milieu de culture.
L’interface entre les Fe3O4@MSN natives et fonctionnalisées de PEG ou de DMPC et les membranes
cellulaires a été étudiée sur des modèles membranaires. Des bicouches lipidiques supportées mimant la partie lipidique de la membrane plasmique ont été déposées sur des supports d’or ou de silice. Sur support d’or, les bicouches de lipides EPC contiennent un lipide d’ancrage, absent des bicouches lipidiques formées sur support de silice. Le dépôt, l’adhésion, et l’arrangement des NPs déposées ont ainsi été étudiées par résonance plasmonique de surface et microbalance à quartz avec suivi de dissipation. L’utilisation de ces modèles membranaires permet d’appréhender les relations entre les propriétés de surface des Fe3O4@MSN, la présence de protéines dans le milieu de dispersion et
l’interaction avec les membranes cellulaires.
B. Nanoparticules d’analogues de bleu de Prusse
Découvert en 1704, le bleu de Prusse (BP), de formule chimique Fe4[Fe(CN)6]3, est le plus ancien
polymère de coordination connu. Ces polymères ont d’abord été utilisés comme pigments (textile, peinture…). Depuis, de nombreux polymères de coordination ont été synthétisés, avec pour formule générale AxMy[M’(CN)6]z, où M et M’ sont des ions métalliques de transition ou des lanthanides et A un
du chrome ou du cobalt. Il existe donc une grande variété de polymères de coordination composés de ponts cyanures. La résolution de la structure cristalline dans les années 70 a révélé une structure cubique de NaCl avec une succession régulière de ponts cyanures entre les métaux M et M’ de coordination (Buser et al., 1974). Cette structure cristalline cubique du matériau permet la synthèse de NPs de forme cubique par reproduction du même motif cristallin pour l’ensemble de la NP.
Les propriétés du BP sont liées à cette structure cristalline cubique conférant des propriétés électroniques (Hoffman et al., 2014), magnétiques (Tokoro and Ohkoshi, 2011) et une porosité particulières. Les cations monovalents captés dans les pores des ABP ont la capacité de s’échanger avec d’autres cations monovalents présents dans le milieu environnant. Cette porosité a permis le développement des capsules Radiogardase®, approuvées par la FDA pour absorber le césium radioactif et le thallium non radioactif en cas d’intoxication chez l’homme (FDA, 2003). Le marquage au thallium radioactif (Tl201) des NPs de BP permet de les suivre par tomoscintigraphie par émission
monophotonique (SPECT-CT) sur un modèle animal comme la souris. De plus, la porosité particulière permet d’incorporer des ions gadolinium qui sont également de bons agents de contraste en IRM (Perrier et al., 2015).
Les ABP présentent des propriétés électroniques intéressantes, ils sont capables d’absorber l’énergie lumineuse dans le proche infrarouge (Hoffman et al., 2014). Cette absorption est due à un transfert d’énergie entre un atome de ferII et un atome de ferIII voisins au niveau des ponts cyanures. Ce
transfert d’énergie permet d’absorber l’énergie lumineuse d’un faisceau laser entre λ = 650 et λ = 900 nm. La réactivité photonique confère aux ABP des propriétés photomagnétiques (Fornasieri and Bleuzen, 2008), photoacoustiques (Liang et al., 2013b), ou encore photothermiques (Hoffman et al., 2014). Ces propriétés peuvent servir à suivre les NPs par imagerie et à contrôler leur activité thérapeutique (hyperthermie ou libération contrôlée de PA).
Afin d’apporter une fonctionnalité supplémentaire aux NPs d’ABP, il est possible de former des NPs de BP de type cœur-coquille. Dans ce projet, des NPs de BP avec un cœur d’or sont utilisées. Lors de la synthèse, le cœur d’or est recouvert d’une couche homogène du polymère Na+/Ni2+/[FeII(CN)
6]3 .
Autour de cette couche, la croissance du polymère Na+/Fe3+/[FeII(CN)
6]3 est irrégulière. Les NPs
formées sont de type Au@NaNiIIFeII@NaFeIIFeIII (ou Au@Na+/Ni2+/[FeII(CN)
6]3-@Na+/Fe3+/[FeII(CN)6]4-).
La présence de l’or apporte des propriétés de résonnance plasmonique de surface localisée (LSPR), avec une large bande d’absorption entre λ = 650 et λ = 900 nm (Jing et al., 2014). L’association des propriétés des ABP (porosité, magnétisme, absorption lumineuse) et de l’or (LSPR) peut conduire à de nouvelles applications médicales de ce type de NPs en imagerie, diagnostic et thérapie.
32
I.
Produits chimiques, biologiques, substrats et réactifs
A.
Les produits chimiques :
L’oxyde de fer hydroxylé [FeO(OH)], l’acide oléique (90 %), l’oléylamine (99 %), l’éther (≥ 99,9 %), la cystéamine, l’Hepes (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique), le sodium dodécyl sulfate (SDS), l’éthanol anhydre (≥99.8 %), le chloroforme, le décane, le pentane anhydre (, ≥ 99 %), le chloroforme anhydre (99+ %), le tetraethylorthosilicate (TEOS, ≥ 99.9 %), le docosane, le bromure de cetyltrimethylammonium (CTAB), le nitrate d’ammonium, le fer(III) chloride hexahydrate (FeCl3×6H2O,
le potassium phosphate KH2PO4, et le sodium phosphate dibasique Na2HPO4-7H2O, proviennent de
Sigma-Aldrich. Le chlorure de sodium (NaCl) a été acheté chez VWR. Le KCl a été obtenu chez Prolabo. L’hydroxyde de sodium (NaOH) et le n-docosane (99 %) ont été fournis par Acros. La solution d’Hellmanex vient de chez Hellma. Le PEG sylanisé (CH3O-PEG2000-Si(OCH3)3) a été obtenu chez Rapp
polymer. Le ferricyanide de potassium (K3[Fe(CN)6], 99%) a été obtenu chez Acros Organics. Le
Nickel(II) chloride hexahydrate (NiCl2×6H2O, 99%) nous a été fourni par Chimica. Le sodium
hexacyanoferrate(II) decahydrate (Na4[Fe(CN)6]×10H2O) provident de chez Alfa Aesar.
B. Les lipides :
Tous les lipides utilisés proviennent de chez Avanti Polar Lipids. Ils ont été choisis en fonction de leur charge et de leur température de transition de phase (Tm). La longueur de chaine, la charge et la Tm des lipides utilisés sont présentés dans le tableau suivant.
Tableau 1 : Caractéristiques des différents lipides utilisés.
Abbréviation Dénomination Longueur de chaine
Température de transition (°C)
Charge
DPPC 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 16 C 41 0 DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane 18 C <5 +1
Exception : le lipide d’ancrage employé pour la formation d’une bicouche lipidique sur une surface d’or, le DSPE-PEG-SPA (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine - polyethylene glycol 2000 - succinimidyl propionate), provient de chez Nanocs (New York, USA).
Les autres produits utilisés sont de qualité analytique (Sigma Aldrich).
C.
Les surfaces :
Supports d’or pour le suivi d’interaction par résonance plasmonique de surface (RPS)
Les supports pour le suivi d’interaction par RPS sont constitués de demi-lames de microscope en verre (MenzelGlaser, Brunswik, Allemagne) d’une épaisseur de 1 mm. Les surfaces de verre sont dégraissées à l’éthanol absolu et rincées à l’eau ultrapure avant d’être trempées 1 h dans un bain d’acide sulfochromique (acide sulfurique + 5 % v/v d’une solution saturée de dichromate de potassium) fraichement préparé (attention produit extrêmement dangereux à manipuler avec précaution!). Les surfaces sont ensuite abondamment rincées à l’eau ultrapure et séchées sous un flux d’azote. Les lames sont alors placées dans un évaporateur, modèle Edwards E306A, sous vide poussé inférieur à 2 .10-6 mbar (Edwards SA, Gennevilliers, France). Une couche de chrome de 2 ± 0,5 nm est alors
déposée par évaporation thermique à une vitesse de 0,1 nm s-1, suivi par le dépôt d’une couche de
47 ± 1 nm d’or. Le dépôt est suivi par un système de contrôle de l’épaisseur par microbalance à quartz FTM (Edwards SA). La couche de chrome sert d’accroche pour l’or sur le verre. Les substrats recouverts d’or sont stockés sous atmosphère inerte pour éviter l’oxydation de la surface d’or par l’air et la contamination des surfaces. Ces lames recouvertes d’or ont été en grande partie produites par le Dr. Claire Rossi, à l’Université de Technologie de Compiègne. Des lames d’or commerciales de même dimension ont également été fournies par la plateforme FEMTO-ST (Besançon, France).
Les surfaces pour les mesures par QCM-D
34 senseur peut ensuite être recouverte en surface par différents matériaux. Des surfaces recouvertes de silice SiO2 sont utilisées dans le cadre de ce travail. Les quartz sont fournis par la société Biolin
Scientific.
D.
Tampons et milieux :
Les tampons utilisés sont des tampons phosphate (KH2PO4 1,5 mM ; Na2HPO4-7H2O 8,0 mM) ou
tampons Hepes (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) 20 mM préparés dans de l’eau ultrapure (Millipore, 18 MΩ cm). Pour plus de simplicité, les tampons phosphates sont abrégés PBS (Phosphate Buffered Saline) et les tampons Hepes sont abrégés HBS (Hepes Buffered Saline) :
- Tampon PBS 138 mM NaCl : KH2PO4 1,5 mM, Na2HPO4.7H2O 8,0 mM, KCl 3 mM, NaCl 138 mM,
pH 7,4.
- Tampon HBS 150 mM NaCl : Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. - Tampon HBS 5 mM NaCl : Hepes 20 mM, NaCl 5 mM, pH 7,4.
Après avoir équilibré le pH avec du NaOH, tous les tampons sont filtrés sur un filtre d’acétate de cellulose Minisart® NML 0,2 µm (Sartorius Stedim, Göttingen, Allemagne) et dégazés dans un bain à ultrasons 35 W, 35 kHz pendant 20 min (Bioblock Scientific, Strasbourg, France). Les tampons ainsi préparés peuvent être stockés à 4 °C (au maximum 10 jours). Ils sont remis à température ambiante avant chaque utilisation.
Les autres milieux utilisés sont :
- RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium), complété avec 10 % de sérum de veau fœtal (SVF), L-glutamine, pénicilline et streptomycine (produits fournis par Invitrogen).
- HBS 10 % SVF : Hepes 20mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 complété avec 10 % SVF
II.
Synthèse des nanoparticules (NPs)
La synthèse des NPs se fait par voie « bottom-up », avec formation des NPs à partir des précurseurs, couche après couche. Les NPs « cœur-coquille » de Fe3O4@MSN et Au@BP sont formées en deux
étapes : la formation du cœur d’une part et croissance de la coquille d’autre part.
A.
Nanoparticules Fe
3O
4@MSN
Synthèse des nanocristaux magnétiques (NCM)
