Interaction protéine-protéine

Les interactions protéine-protéine sont essentielles pour le fonctionnement de la cellule, car elles sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires comme la régulation génique, la réponse immunitaire et les voies de signalisation (Veselovsky et al. 2002; Cho et al. 2005; Tuncbag et al. 2008). Elles peuvent avoir lieu entre des protéines identiques ou non-identiques (homo-oligomères ou hétéro-oligomères). Les oligomères impliquant des protéines identiques ou homologues peuvent être divisés selon deux types de liaison, c’est-à-dire une association qui implique la même surface pour les deux protéines ou qui implique des surfaces différentes (Goodsell and Olson 2000). Ensuite, ces oligomères peuvent être divisés selon le type de complexe qu’ils forment. Deux possibilités sont possibles: il peut s’agir d’un complexe obligatoire ou non obligatoire (Amoutzias 2010). Pour qu’un complexe soit obligatoire, il ne faut pas que les protéines impliquées soient retrouvées sous une forme stable lorsqu’elles sont sous une forme monomérique. Plusieurs complexes protéiques se catégorisent dans cette classe comme les complexes de signalisation intracellulaire et les complexes antigènes-anticorps (Nooren and Thornton 2003). Pour ce qui est des complexes non-obligatoires, c’est l’inverse : les protéines sont stables lorsqu’elles sont sous une forme monomérique (Amoutzias 2010). Dans le cas des UGT, tout porte à croire qu’elles forment des complexes non-obligatoires (Fujiwara et al. 2007; Operana and Tukey 2007).

Les complexes peuvent ensuite être distingués selon leur durée de vie. Pour ce faire, on retrouve des interactions permanentes qui sont très stables et qui impliquent des protéines existant seulement sous la forme de complexe, et des interactions transitoires qui se résument par une association ou une dissociation des protéines impliquées (Nooren and Thornton 2003; Brown and Jurisica 2007). Le complexe hétéromère de la protéine G est un

excellent exemple d’interaction transitoire. En effet, ce complexe comporte trois unités qui peuvent être associées lors d’une activation par un récepteur pour finalement être dissociées : le récepteur couplé aux protéines G, la sous-unité Gα et le complexe Gβγ

(Winzell and Ahren 2007). Il est à noter que les complexes sont dynamiques, donc il est possible de retrouver un équilibre entre des liaisons obligatoires ou non, car la stabilité des complexes est sous l’influence d’un grand nombre de facteurs physicochimiques comme la concentration d’ions, le pH et la température (Archakov et al. 2003; Amoutzias 2010). De plus, les interactions permanentes sont souvent obligatoires et conservées tandis que les interactions transitoires peuvent être obligatoires ou non et sont généralement peu conservées, mais dominantes chez l’homme (Mintseris and Weng 2005; Brown and Jurisica 2007).

La structure primaire est aussi importante pour la formation d’interaction protéine- protéine. En effet, des auteurs ont démontré que certains résidus étaient plus abondants dans les surfaces d’interaction que d’autres. On retrouve des résidus tels que l’arginine, l’histidine, l’asparagine, le tryptophane, la tyrosine et la sérine ainsi que des acides aminés aromatiques et hydrophobes (Davies and Cohen 1996; Jones and Thornton 1996; Stites 1997). Ces molécules impliquent plusieurs facteurs biophysiques qui permettent des liaisons non-covalentes. Les plus importants sont les forces hydrophobes, les forces électrostatiques et les liaisons hydrogènes (Veselovsky et al. 2002; Pechmann et al. 2009).

Pour commencer, l’interaction hydrophobe est la force qui contribue le plus aux interactions protéine-protéine (Eisenhaber and Argos 1996; Wells 1996). Cette force non polaire d’environ 200-400 Å est très importante chez les complexes permanents contrairement aux complexes non obligatoires, car ces derniers sont assemblés dans un environnement riche en eau, ce qui est défavorable énergétiquement pour les surfaces hydrophobes (Jones and Thornton 1996; Lijnzaad and Argos 1997). Les forces électrostatiques sont les forces les plus importantes après les forces hydrophobes (Gong et al. 2000). Pour qu’il y ait des interactions entre deux protéines via ces forces, il faut que les charges électriques à leurs surfaces soient complémentaires (Veselovsky et al. 2002). D’ailleurs, plus cette force est présente, plus la formation du complexe sera rapide

(Gabdoulline and Wade 1999). Un autre facteur important impliqué est la liaison hydrogène. Cette liaison de type dipôle-dipôle d’environ 110-200 pm est de faible énergie et elle implique un hydrogène et un élément polaire qui est majoritairement l’oxygène (Jones and Thornton 1996; Xu et al. 1997). Certes, cette liaison implique peu d’énergie, mais leur grand nombre résulte à une force globale très importante. En somme, les interactions protéine-protéine sont le résultat de plusieurs liaisons non covalentes via des résidus spécifiques présents à la surface de chacune des protéines.

Malgré le fait que ces forces permettent la création des complexes, elles peuvent aussi être responsables de la formation d’agrégats indésirables qui peuvent causer des maladies importantes, par exemple la maladie d’Alzheimer et la maladie des prions (Chiti and Dobson 2006). Afin d’éviter de telles situations, la cellule a développé des mécanismes de contrôle de qualité comme les protéines « heat shock » afin d’empêcher les protéines avec une mauvaise conformation de former, entre autres, des agrégats avec d’autres protéines qui normalement ne sont pas partenaires (Pechmann et al. 2009). Il existe toutefois des résidus spécifiques qui agissent comme des résidus protecteurs contre des repliements indésirables (Fass 2012). En effet, Pechman et son équipe ont démontré l’existence de résidus permettant des interactions intramoléculaires près de l’interface de la protéine afin d’empêcher cette dernière d’adopter une mauvaise conformation après une perturbation et ainsi former un agrégat (Pechmann et al. 2009). Donc, ces résidus empêchent la formation de certaines zones hydrophobes à la surface de la protéine qui n’existe pas normalement. Dans 92 % des complexes qu’ils ont étudiés, ils ont découvert la présence de ponts disulfures et de ponts ioniques en proximité des interfaces d’interaction. Ces liaisons permettent la stabilité des protéines et permettent de prévenir des changements de conformation lors d’un changement dans la physicochimie de la cellule.

L’étude de ces interactions est essentielle dans l’élaboration de nouvelles drogues synthétiques. Plusieurs interactions non spécifiques sont connues pour causer des maladies, ce qui représente des cibles thérapeutiques intéressantes (Chiti and Dobson 2006). Dans le cas présent, l’identification des domaines d’interaction entre les isoformes i1 et i2 permettrait le développement éventuel de molécules synthétiques permettant de moduler la

voie de glucuronidation. Pour ce faire, il s’agit de créer une molécule capable de mimer cette interaction, mais pour que cela soit possible, il faut d’abord connaitre les domaines impliqués dans l’interaction, et ce, à l’aide de différentes techniques comme la co- immunoprécipitation et l’élaboration de modèles comportant des mutations (Miernyk and Thelen 2008).

Problématique, hypothèse et objectifs

Les travaux présentés dans ce mémoire se basent sur les domaines d’interaction déjà identifiés pour les protéines UGT et visent à déterminer si ces domaines affectent l’interaction entre les formes d’épissage i1 et i2. Puisque l’effet de modulateur négatif de i2 semble être associé à des interactions directes entre les deux protéines, l’hypothèse des travaux stipule que l’inhibition de l’activité de glucuronidation par l’isoforme 2 est le résultat d’interactions protéine-protéine entre les isoformes i1 et i2 via plus d’un domaine protéique. Pour ce faire, le premier objectif était de créer des protéines tronquées de i1 et i2 et de déterminer si l’interaction était encore présente par co-immunoprécipitation (co-IP). Nous avons donc mis au point des vecteurs d’expression possédant différentes délétions de i1 pour ensuite les transfecter avec la forme sauvage de l’isoforme i2. La lignée cellulaire qui a été choisie est une lignée de cellules rénales embryonnaires (HEK293) qui ont l’avantage de ne pas exprimer les UGT. De plus, nous avons choisi l’isoenzyme UGT1A1 qui est impliquée dans la conjugaison de la bilirubine. Chaque isoforme est étiquetée V5 et les formes tronquées étaient étiquetées myc permettant ainsi de cibler l’étiquette d’un premier isoforme pour une immunoprécipitation et de révéler la deuxième forme d’épissage en immunobuvardage de type Western à l’aide de la deuxième étiquette. Finalement, les différentes lignées cellulaires ont été lysées et utilisées pour une co-IP afin de déterminer si la forme tronquée pouvait interagir avec son partenaire. Le deuxième objectif était de tester l’implication de liens covalents de type ponts disulfures et d’explorer individuellement l’implication de différentes cystéines dans cette interaction. Les constructions UGT1A1_i1/myc-his et UGT1A1_i2/V5-his ont été transfectées dans des HEK293 afin de valider la présence de ponts disulfures résultant à des complexes à haut poids moléculaires à l’aide de SDS-PAGE en conditions non-réductrices. Ces expériences ont ensuite été effectuées en conditions réductrices afin de s’assurer que ces complexes deviennent sous forme de monomère. Par la suite, nous avons muté par mutagénèse dirigée chacune des cystéines ciblées et les constructions ont été co-transfectées avec la forme sauvage de i1 ou de i2. Finalement, des expériences de co-IP ont été effectuées afin de déterminer l’implication individuelle des cystéines dans l’interaction des i1-i1 et des i1-i2.

Ultimement, ces connaissances quant aux domaines potentiels impliqués dans l’interaction i1-i2 nous permettront d’envisager le développement de nouveaux outils pharmacologiques telle la synthèse d’inhibiteur ciblant spécifiquement le(s) site(s) de liaisons entre les deux isoformes afin de moduler l’activité de glucuronidation par les enzymes UGT1A.

Résultats

Étude des interactions protéiques entre les formes

d’épissage du gène ugt1a1

Résumé

Interactions protéines-protéines entre l’UDP-glucuronosyltransférase 1A1 (UGT1A1) active et sa forme courte, l’isoforme 2, dérivée de l’épissage alternatif.

Mélanie Rouleau, Pierre Collin, Judith Bellemare, Mario Harvey et Chantal Guillemette

L’épissage alternatif du gène UGT1A entraine la production d’enzymes actives, les isoformes 1 (i1), et de protéines tronquées, les isoformes 2 (i2), qui possèdent des propriétés modulatrices sur l’activité enzymatique des i1 à l’aide d’interactions protéines- protéines. Il est connu que les UGT peuvent former des oligomères, mais rien n’est connu en ce qui a trait au domaine d’interaction entre les isoformes 1 et 2. Nos résultats démontrent que les isoformes i1 dépourvues du signal peptide avec ou sans domaine transmembranaire empêchent l’homo-oligomérisation sans toutefois affecter l’interaction avec i2. Des délétions d’autres domaines situés dans la région N-terminale et C-terminale n’empêchent pas la formation des différents complexes. De plus, la présence de complexes de hauts poids moléculaires observée par immunobuvardages en conditions non réductrices démontre l’implication de ponts disulfures dans la formation des complexes i1-i2, et ce via plusieurs résidus cystéines. En somme, les résultats obtenus démontrent que l’interaction i1-i2 implique plusieurs domaines protéiques et qu’ils diffèrent de ceux impliqués dans le complexe i1-i1.

Protein-protein interactions between the bilirubin-conjugating UDP-

glucuronosyltransferase UGT1A1 and its shorter isoform 2 regulatory partner derived from alternative splicing.

Mélanie ROULEAU, Pierre COLLIN, Judith BELLEMARE, Mario HARVEY and Chantal GUILLEMETTE*

*Pharmacogenomics Laboratory, Centre Hospitalier Universitaire de Québec (CHUQ) Research Center, 2705 Boul. Laurier, G1V 4G2, Québec, Canada and Faculty of Pharmacy, Laval University.

Short title: Protein-protein interactions between UGT1A1 spliced isoforms FOOTNOTES

Author to whom correspondence should be sent: Chantal Guillemette, Ph.D.

Canada Research Chair in Pharmacogenomics Pharmacogenomics Laboratory

Centre Hospitalier Universitaire de Québec (CHUQ) Research Center, T3-48 2705 Boul. Laurier

Québec, Canada, G1V 4G2

Tel.: (418) 654-2296 Fax: (418) 654-2298 E-mail: Chantal.Guillemette@crchul.ulaval.ca

Abbreviations used: UGT, UDP-glucuronosyltransferases; i1, isoform 1; i2, isoform 2; co-IP, co- immunoprecipitation; ER, endoplasmic reticulum; MRA, micro-anchoring region; HMWC, high molecular weight complexes; SP, signal peptide; TMD, transmembrane domain; MS, mass spectrometry

ABSTRACT

Oligomerization of UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) modulates their enzyme activities. Recent findings also indicate that glucuronidation is negatively regulated by the formation of inactive oligomeric complexes between UGT1A enzymes (isoforms 1 or i1) and an enzymatically inactive alternatively spliced i2. Here, we assessed whether deletion of UGT-interacting domains previously reported to be critical for enzyme function might be involved in i1-i2 interactions. The bilirubin-conjugating UGT1A1 was used as a prototype. We also explored if intermolecular disulfide bonds are involved in i1-i2 interactions and the potential role of selected cysteines. Co-immunoprecipitation assays showed that UGT1A1 lacking the signal peptide alone or also lacking the transmembrane domain (absent in i2) did not self-interact but still interacted with i2. Deletion of other N- or C-terminal domains did not compromise i1-i2 complex formation. Under non-reducing conditions, we also observed formation of high-molecular-weight complexes for cells overexpressing i1 and i2. The presence of UGTs in these complexes was confirmed by MS. Mutation of individual cysteines throughout UGT1A1 did not compromise i1-i1 or i1-i2 complex formation. These findings are compatible with the hypothesis that the interaction between i1 and i2 proteins (either transient or stable) involves binding of more than one domain that likely differs from those involved in i1-i1 interactions.

Key words: UGT, alternative splice products, protein-protein interaction, dominant- negative regulation, membrane protein.

INTRODUCTION

The functions of most proteins depend on continuous interactions with other proteins or molecules [1]. The study of protein interactomes is a growing field, and numerous studies have attempted to characterize interactomes for various biological processes and/or for different cell types or tissues. The finding that most human genes are subject to alternative pre-mRNA splicing has demonstrated a key process for protein diversity and for regulating various biological processes [2-4]. Both processes—splicing and protein-protein interactions—reportedly affect small-molecule biotransforming pathways such as those governed by the superfamily of UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) [5-12].

Human UGTs are an important class of conjugating enzymes that play a key role in several important metabolic processes and exhibit broad substrate specificity. Indeed, those enzymes catalyze the glucuronidation of a wide range of structurally unrelated endogenous and xenobiotic chemicals, including numerous therapeutic drugs [13, 14]. UGTs are type I membrane proteins of the endoplasmic reticulum (ER) classified in two major families, UGT1A and UGT2 (2A and 2B) [13]. The ~190-kb UGT1A locus produces half of the enzymatically active human UGT enzymes. Alternative usage of variable first exons encoding the substrate-binding domain leads to nine active UGT1A enzymes, called isoforms 1 or i1 [15]. Recently, alternative splicing at the 3’-end of this locus was revealed, resulting from the presence of an additional/shorter terminal exon (exon 5b) and leading to nine shorter UGT1A proteins (named isoforms 2 or i2) [16, 17].

UGT1A_i2 alternative protein isoforms lack glucuronic acid transferase activity but are residents of the ER despite lacking the transmembrane domain (TMD) [17]. Functional assays with human cells co-expressing i1 enzymes and i2 variant isoforms have clearly demonstrated a significant decrease in cellular glucuronidation activity for many different UGT1A substrates, supporting a regulatory role for i2 proteins [16-21]. Furthermore, co- immunoprecipitation (co-IP) experiments support protein-protein interactions between i1 and i2 proteins in heterologous expression systems [17-19]. Also, the cellular co- localization of UGT1A isoforms supports molecular interaction between them. The

mechanism underlying the regulation of transferase activity by splice forms has become even more complex with the recent demonstration of heterodimer formation between all UGT1A_i1 and other i2 isoforms [19]. Current data thus suggest that glucuronidation is negatively regulated by interactions between active i1 enzymes and alternatively spliced i2 regulatory proteins through formation of enzymatically inactive complexes.

Function of UGTs as oligomeric complexes and their regulation through protein-protein interactions has been documented (see recent reviews [11, 22]). Oligomerization of two inactive mutants was even shown to yield an active enzyme complex [23]. Previous studies point to several potential protein domains that may regulate oligomerization/activity or subcellular localization (Table 1). For instance, domains of the N-terminal portion of UGT, such as the signal peptide and a hydrophobic region (called micro-anchoring region, or MRA, residues 152–180 in UGT1A1), are critical for enzymatic activity and localization to the ER membrane [24-27]. The MRA is also likely involved in UGT oligomerization [28]. Recent protein homology modeling identified a putative dimerization domain for UGT2B7 located between residues 180 and 200 [29]. The C-terminal portion has also been studied. Experiments showed that the C-terminal tail (residues 510–534) and TMD (residues 490– 510) are not essential for hetero-oligomerization of UGT [23, 28], although deletion of one or the other significantly affects enzyme activity [23, 27, 30, 31]. Although protein-protein interactions typically are non-covalent and thus reversible [32, 33], some studies also suggest that UGT oligomerization could occur via covalent interactions. For instance, the presence of high-molecular-weight complexes (HMWC) under non-reducing conditions in SDS-PAGE suggests the possibility of disulfide bonds between UGTs [23, 28, 34].

Based on these observations, we assessed whether deletion of UGT domains previously reported to be critical for enzyme function, oligomerization, and cellular localization might mediate protein-protein interactions between i1 and i2 isoforms. We then explored whether relatively stronger intermolecular disulfide bonds are involved in these interactions and the potential role of specific cysteines using site-directed mutagenesis. The bilirubin- conjugating UGT1A1 was used as a prototype. We provide direct experimental evidence that the domain(s) critical for interaction between i1-i2 likely differs from that involved in

i1-i1 interactions. The formation of large molecular complexes was further demonstrated, but the identity of the cysteines responsible for those interactions remains unknown.

EXPERIMENTAL

Preparation of Microsomes, and SDS-PAGE

Human cells were disrupted by sonication (3  10 s on ice with a 10 s pause in between each sonication; 550 Sonic Dismembrator, Fisher Scientific) and centrifuged twice at 12,200 g for 20 min to remove nuclear components cell debris. The endoplasmic reticulum membrane fraction was then collected by sedimentation of the supernatant at 105,000 g for 1 h. The protein concentration was determined using the Bradford method. The microsomal protein extracts were diluted in 4 non-reducing buffer containing 6.85% SDS, 233.3 mM Tris-HCl pH 6.8, 24% glycerol, 0.008% bromophenol blue, and resolved by SDS-PAGE (10% polyacrylamide gel). Under reducing conditions, samples were heated in the 4x buffer, which was completed with 0.85% final concentration of β-mercaptoethanol as a reducing agent. Protein levels in HEK293 cells overexpressing either i1/myc-his alone or i1/myc-his coexpressed with i2/v5-his were determined by Western blotting using an antibody against either myc (Cedarlane, ON, Canada, 1:1500), or V5 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, 1:5000).

LC-MS/MS Analysis

SDS-PAGE lanes corresponding to non-reducing conditions of UGT1A1-overexpressing HEK293 cells were cut into six gel slices per lane. In-gel protein digestion was performed on a MassPrep liquid handling station (Waters, Mississauga, ON, Canada) according to the manufacturer’s specifications and using sequencing-grade modified trypsin (Promega, Madison, WI, USA). Cell extracts containing peptides were dried using a SpeedVac (Thermo Scientific, ON, Canada) and then separated by online reversed-phase nanoscale capillary liquid chromatography and analyzed by electrospray MS/MS as described [35]. Briefly, an LTQ linear ion trap mass spectrometer (Thermo Electron, San Jose, CA, USA) equipped with a nanoelectrospray ion source (Thermo Electron) was used. Peptides were separated with a PicoFrit column BioBasic C18, 10 cm  0.075 mm internal diameter (New

Objective, Woburn, MA, USA), with a linear gradient from 2% to 50% solvent B (acetonitrile, 0.1% formic acid) in 30 min, at 200 nl/min. Each full-scan mass spectrum (400–2000 m/z) was followed by collision-induced dissociation of the seven most intense ions. All MS/MS samples were analyzed using Mascot (Matrix Science, London, U.K. version 2.3) with the human uniref_100 protein database (Homo sapiens: Taxon 9606, 100,683 entries) assuming trypsin digestion. Two missed cleavages were allowed. Scaffold (version 03_00_02; Proteome Software, Inc., Portland, OR, USA) was used to validate MS/MS-based peptide and protein identifications, which were accepted if they could be established at >95.0% probability as specified by the Peptide Prophet algorithm and contained at least two identified peptides [36].

Site-directed Mutagenesis

Site-directed mutagenesis was done to replace specific cysteine residues of i1 cDNA with tyrosine (Table 2). The UGT1A1 cDNA was subjected to oligonucleotide-mediated mutagenesis with Pfu turbo DNA polymerase (Agilent, Mississauga, ON, Canada). Oligonucleotides were obtained from IDT (Coralville, IA, USA). Human UGT1A1_i1 was use as template DNA for PCR reaction which was cloned into pcDNA3.1A/myc-his (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). PCR was performed on pcDNA3.1A/myc-his for i1, at 94°C for 30 s, followed by 21 cycles of 94°C for 30 s, 55°C for 60 s, and 68°C for 16 min. Site-directed mutagenesis was followed by digestion with Dpn 1 to eliminate parental DNA (Roche Applied Science, Laval, Qc, Canada). Digestion products were then transformed into Escherichia coli XL-1 blue. Growing colonies were assessed for the presence of the correct point mutation, which was confirmed by direct sequencing.

Generation of UGT1A1 Mutated Proteins

Mutated cDNAs for i1/myc-his and i2/v5-his were generated with overlap extension PCR as described [37]. This method relies on two oligonucleotides that overlap the deletion to be made. Human UGT1A1_i1 and UGT1A1_i2 were use as template DNA for PCR reaction.