Instrumentation et conditions chromatographiques

Le système chromatographique est composé d'une chaîne HPLC Shimadzu comprenant un sélecteur de solvant, un dégazeur, une pompe binaire haute pression, un passeur d’échantillons réfrigéré, un four multi-colonnes thermostaté et un ensemble de vannes de commutation de colonnes.

La phase stationnaire utilisée est de type C18 (apolaire). Il s’agit d’une colonne Alltima HP C18 HL 3µm 150 x 3 mm (Grace Discovery Sciences) thermostatée à 40°C. La phase mobile est un mélange de 70v d’acétonitrile et 30v de Formiate d’ammonium 2mM à 0,2% d’acide formique. Le pompage est en mode isocratique au débit de 0,4 ml/min.

La majorité des méthodes HPLC utilisent des tampons comme phase mobile pour la séparation des analytes. Quand le système de chromatographie liquide est couplé à un détecteur de masse, toute phase mobile contenant un sel non-volatil est à proscrire. De tels sels s'accumulent dans la source d'ionisation, entraînant ainsi rapidement des problèmes lors de l'ionisation. Une phase mobile contenant un acide organique très volatil, comme l'acide formique utilisé ici, demeure une solution idéale pour fournir une source de protons

L'ajustement du pH de la phase mobile est nécessaire pour obtenir une résolution optimale en HPLC. Mais cet ajustement peut affecter de manière significative la sensibilité en spectrométrie de masse. Pour la majorité des techniques HPLC standard, les analytes sont plus fortement retenus quand ils sont sous forme non ionisés. Mais dans le cas de la spectrométrie de masse, la stratégie est différente : les composés, séparés selon leur rapport m/z, doivent être sous forme ionisée pour être détectés. Quand la phase mobile permet d'introduire les analytes déjà sous forme ionisée, la sensibilité de la détection est beaucoup plus élevée (98). Par exemple, les bases, comme la nicardipine, existent sous forme protonée à pH = pKa - 2, alors que les analytes acides, comme les acides carboxyliques existent sous forme déprotonée à pH = pKa + 2. En conséquence, les bases subissent une protonation à pH faible, tandis que les analytes acides sont déprotonés à pH élevé. Dans notre cas, le pH de la phase mobile est voisin de 3,2. La nicardipine est donc sous forme ionisée.

Les conditions chromatographiques retenues sont les mêmes que celles appliquées au dosage de l’acide mycophénolique dans le laboratoire de pharmacocinétique. Cette configuration nous a permis un enchaînement des analyses sans perturber l'activité de routine du laboratoire.

Le détecteur est un spectromètre de masse 3200 QTRAP (Sciex), un triple quadripôle équipé d’une trappe d’ion linéaire. Il s'agit d'un appareil de type hybride associant les potentialités d'un triple quadripôle en terme de quantification à l'efficacité d'un piège à ions linéaire pour la recherche et l'identification de composés présents dans un mélange complexe. Il permet, par mesure de la masse moléculaire, de détecter, d’identifier et de quantifier les molécules d’intérêt qui auront été préalablement séparées sur le système chromatographique. Il est équipé d'une source ESI (Electrospray Ionization). Il s'agit d'une source d'ionisation douce opérant à pression atmosphérique permettant de produire en

mode d’ionisation positif, des ions moléculaires chargés en phase gazeuse du type [M+H]+

Les médicaments qui ont des groupes fonctionnels basiques (par exemple, des amines) sont ionisés en mode positif, tandis que ceux contenant des groupes fonctionnels acides, comme des acides carboxyliques s'ionisent en mode négatif. Les inhibiteurs calciques s'ionisent en mode positif (98).

Les ions précurseurs [M+H]+ _{ainsi formés sont ensuite transférés vers le premier}

quadripôle (Q1), réglé pour ne laisser passer que ces ions. Puis ils atteignent le deuxième quadripôle où de l'azote ultra pur est introduit. Il s'agit d'une cellule de collision : les ions précurseurs se fragmentent en ions fragments caractéristiques de la molécule à analyser (spectre de fragmentation unique pour chaque molécule). Ces ions fragments sont expulsés vers le dernier quadripôle (Q3), où ils sont filtrés pour atteindre le détecteur : un multiplicateur d'électrons. De cette manière, les ions séparés selon leur rapport masse/charge viennent percuter le détecteur ou cellule CEM (Channel Electron Multiplier) afin d’être détectés et comptabilisés. Ce principe de fonctionnement est appelé mode MRM (Multiple Reaction Monitoring). C'est le mode le plus adapté à la quantification.

Le tout est piloté par le logiciel Analyst®_.

Le système utilisé est représenté dans la figure 13.

Figure 13 : Système chromatographique du laboratoire de Pharmacocinétique du CHU de Rouen

Les transitions MRM de quantification (ion précurseur > ion fragment) ont été déterminées en mode infusion pour la nicardipine et son analogue deutéré. L'infusion dans le

spectromètre de masse a permis d’optimiser leur détection et de définir les transitions à inclure dans la méthode. Les paramètres concernés sont :

• la tension d’orifice (DP : Declustering Potential), • le potentiel d’entrée (EP : Entrance Potential),

• le potentiel d’entrée de la cellule de collision (CEP : Cell Entrance Potential), • l’énergie de collision (CE : Collision Energy),

• et le potentiel de sortie de la cellule de collision (CXP : Cell Exit Potential).

Deux transitions par molécule ont ainsi été déterminées. La transition MRM la plus abondante est choisie comme transition de quantification et une deuxième transition est choisie en tant que transition de confirmation.

Les conditions optimales retenues sont présentent dans les tableaux 1 et 2. Tableau 1 : Transitions MRM de la nicardipine et de la nicardipine-D3

Tableau 2 : Conditions optimales retenues pour le réglage du spéctromètre (psi : pound-force per square inch)

Ces conditions ont permis d'obtenir des pics parfaitement définis et parfaitement reproductibles d'une injection à l’autre, avec un temps d'analyse très court (Figure 14).

Figure 14 : Chromatogramme de la nicardipine