Influence des niveaux d’inoculation des compétiteurs

Afin de définir le seuil à partir duquel apparaît l’inhibition de la croissance et de la production d’OTA, des essais ont été réalisés en faisant varier les niveaux d’inoculation des différents couples compétiteurs (Awe/An et Awe/Ao). La croissance apicale et la production d’OTA ont été mesurées à J3, J5 et J7 après co-ensemencement central des boîtes de Pétri (milieu PDA pH 3,5) avec 5 µL d’une suspension à 10⁶ spores/mL de Awe et 5 µL d’une suspension à 10⁶ ou 10⁴ ou 10² spores/mL de An ou Ao. Les valeurs obtenues en co-cultures ont été comparées à celles obtenues pour les souches cultivées individuellement.

169 3.3.2.1. Couple compétiteur Aspergillus westerdijkiae/ Aspergillus

niger (Awe/An)

Quelque soit le niveau d’inoculation de An en présence Awe inoculé à 10⁶ spores/mL, la croissance de An est identique au témoin An ensemencé à 10⁶ spores/mL (Figure 3.3.4).

La croissance de Awe est fortement inhibée par An dès J3 pour un niveau d’inoculation pour An compris entre 10² spores/mL et 10⁴ spores/mL (respectivement 44% et 96 % d’inhibition à J3) (Figure 3.3.4). Au cours du temps, les taux d’inhibition obtenus pour les niveaux d’inoculation à 10⁶ spores/mL et 10⁴ spores/mL ont tendance à diminuer et à rejoindre l’inhibition toujours croissante observée pour le niveau d’inoculation à 10² spores/mL à 7 jours. A ce temps d’incubation, la croissance de Awe est inhibée de 68 à 78 % pour tous les niveaux d’inoculation. En ce qui concerne la production d’OTA, celle-ci est déjà fortement diminuée pour le niveau d’inoculation à 10² spores/mL : 11.8 ppb à J5 contre 13800 ppb pour le témoin Awe cultivé seul. Pour les 2 autres niveaux d’inoculation, la production est presque nulle et même An ne produit pas autant que dans le témoin An cultivé seul. Quelque soit le milieu où An est présent, la teneur en OTA est nulle à J7, ce qui évoque une consommation de la toxine par cette souche faiblement productrice même quand elle la produit elle même (Figure 3.3.5). Varga et al. (2000) ont montré que A. niger (CBS 120.49) était capable de réduire de 80 % en 2 jours un apport initial de 500 ppm d’OTA en milieu solide, pour le convertir totalement en 5 jours en OTα qui disparaissait ensuite à 7 jours. Dans les travaux de Bejaoui et al. (2006), les souches d’A.niger se sont montrées les plus efficaces en terme de dégradation de l’OTA parmi toutes les souches de la section Nigri testées en milieu synthétique enrichi en OTA (2 ppm).

170 Figure 3.3.4 : Inhibition de la croissance de Aspergillus westerdijkiae (Awe) par

Aspergillus niger (An) après co-ensemencement central sur milieu PDA pH 3,5 pour

différents niveaux d’inoculation de Aspergillus niger (An) (5 µL d’une suspension à 10⁶spores/mL de Aspergillus westerdijkiae (Awe) et 5 µL d’une suspension à 10⁶ ou 10⁴ ou 10² spores/mL de Aspergillus niger (An))

171 Figure 3.3.5 : Production d’OTA par Aspergillus westerdijkiae (Awe) et Aspergillus

niger (An) après co-ensemencement central sur milieu PDA pH 3,5 pour différents

niveaux d’inoculation de Aspergillus niger (An) (5 µL d’une suspension à 10⁶spores/mL de Aspergillus westerdijkiae (Awe) et 5 µL d’une suspension à 10⁶ ou 10⁴ ou 10² spores/mL de Aspergillus niger (An))

3.3.2.2. Couple compétiteur Aspergillus westerdijkiae/ Aspergillus ochraceus (Awe/Ao).

Des mesures de croissance apicale ont été réalisées à J3, J5 et J7 mais la distinction n’a pu être faite entre les colonies des deux souches en raison de leurs ressemblances phénotypiques. C’est donc le diamètre global qui a été mesuré et représenté sur la Figure 3.3.6. Les couples Awe/Ao ont une croissance identique à celle des souches cultivées seules mais il est impossible de déterminer visuellement la croissance de l’une et de l’autre.

172 Figure 3.3.6 : Croissance apicale à 3 (J3), 5 (J5) et 7 (J7) jours après

co-ensemencement central sur milieu PDA pH 3.5 de Aspergillus westerdijkiae (Awe) par Aspergillus ochraceus (Ao) après co-ensemencement central sur milieu PDA pH 3,5 pour différents niveaux d’inoculation de Aspergillus ochraceus (Ao) (5 µL d’une suspension à 10⁶spores/mL de Aspergillus westerdijkiae (Awe) et 5 µL d’une suspension à 10⁶ ou 10⁴ ou 10² spores/mL de Aspergillus ochraceus (Ao))

Dans cette étude, nous avons donc utilisé la méthodologie mise au point dans le chapitre précédent (Chapitre 4) dans l’optique d’accéder à une« quantification » différentielle des deux souches Aspergillus westerdijkiae et Aspergillus ochraceus, qui sont visuellement indiscernables. Le but était, après séparation par DGGE et grâce à l’analyse d’image des gels, de déterminer un pourcentage d’inhibition de croissance calculé à partir d’un témoin Aspergillus westerdijikiae traité dans les mêmes conditions (extraction, amplification, DGGE, analyse d’image). L’extraction d’ADN a été réalisée sur l’ensemble de la colonie pour toutes les modalités et prélèvements, ce qui permet de suivre l’évolution de la croissance des deux souches au cours de l’expérience. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 J3 J5 J7 D ia m è tr e d e s c o lo n ie s e n m m Jours AW AWAOexp2 AWAOexp4 AWAOexp6 AO

173

L’observation du gel DGGE (Figure 3.3.7) nous permet de visualiser les différences d’intensité des bandes d’A.westerdijkiae, seul ou en co-cultures avec A.ochraceus inoculé à différents niveaux de concentration en spores. Le niveau d’inoculation en spores d’A.ochraceus, semble avoir une influence sur le développement d’A.westerdijkiae (intensité dégressive des bandes avec le taux croissant d’inoculation en Ao).

Figure 3.3.7 : Gel DGGE représentant à des jours différents (3,5 et 7 jours) la

croissance d’A.westerdijkiae seul et en co-culture avec A.ochraceus à différents niveaux d’inoculation de Ao (5 µL d’une suspension à 10⁶spores/mL de Awe et 5 µL d’une suspension à 10⁶ ou 10⁴ de Ao)

174 Figure 3.3.8 : Inhibition de la croissance de Aspergillus westerdijkiae (Awe) par

Aspergillus ochraceus (Ao) après co-ensemencement central sur milieu PDA pH 3,5

pour différents niveaux d’inoculation de Aspergillus ochraceus (Ao) (5 µL d’une suspension à 10⁶ spores/mL de Awe et 5 µL d’une suspension à 10⁶ ou 10⁴ de Ao)

La Figure 3.3.8 a été réalisée en utilisant les valeurs d’intensité de bandes obtenues par analyse d’image du gel DGGE. Le pourcentage d’inhibition de la croissance de Awe en co-culture avec Ao est calculé par rapport au témoin Awe cultivé seul. Quel que soit le niveau d’inoculation de Ao une limitation de la croissance de Awe est observée. Toutefois l’effet est nettement plus marqué pour une inoculation en Ao de 10⁶ spores/mL. Dans ce cas l’inhibition est en moyenne de 75% alors qu’elle est en moyenne de 90% dans les mêmes conditions pour le couple Awe/An. Pour une inoculation en Ao de 10⁴ spores/mL il semble que l’inhibition diminue en fonction du temps puisque celle-ci passe de 20 à 8% en 4 jours.

La production d’OTA (Figure 3.3.9) par Awe est également inhibée par Ao quelque soit le niveau d’inoculation avec cette dernière souche. La réduction de la production est toutefois beaucoup moins importante qu’avec An : la production en OTA à J7 est de 39 % inférieure, pour les niveaux d’inoculation à 10² spores/mL et 10⁴spores/mL. Seul le niveau d’inoculation à 10⁶ spores/mL permet une réduction de 100%. Comme

J3 J5 J7

175

il a été observé pour la croissance de Awe pour une inoculation en Ao de 10⁴ spores/mL, il semble que l’inhibition de la production d’OTA diminue elle aussi en fonction du temps puisqu’elle passe de 85% à 60% entre J5 et J7. Dans ce cas, il n’est pas observé de disparition de l’OTA dans les milieux. Il s’agit donc bien d’une inhibition de la production et non pas d’une consommation après production comme avec A. niger. La réduction biologique de la teneur en OTA peut s’effectuer par un processus de décontamination par biodégradation (consommation de la toxine) (Abrunhosa et al., 2010) ou par des mécanismes de compétition entre souches toxinogènes et non toxinogènes (Amezqueta et al, 2009). Valero et al. (2007) ont ainsi montré que la présence de souches fongiques non productrices d’OTA sur le raisin réduisait la teneur finale en OTA des produits. Degola et al. (2011) ont également mis en évidence l’efficacité de souches non aflatoxinogènes de A. flavus pour réduire la production de la toxine en co-culture avec des souches productrices.

Figure 3.3.9 : Production d’OTA par Aspergillus westerdijkiae (Awe) et Aspergillus

ochraceus (Ao) après co-ensemencement central sur milieu PDA pH 3,5 pour

différents niveaux d’inoculation de Aspergillus ochraceus (Ao) (5 µL d’une

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 J3 J5 J7 O T A µ g /k g d e m il ie u Awe Awe/Aoexp2 AweAoexp4 AweAoexp6 Ao

Awe/Ao exp6 et Ao les 2 courbes sont confondues

176

suspension à 10⁶spores/mL de Aspergillus westerdijkiae (Awe) et 5 µL d’une suspension à 10⁶ ou 10⁴ ou 10² spores/mL de Aspergillus ochraceus (Ao))

3.3.3.

Etude du mécanisme de compétition