Indices de condition

4.3.1 Indice de condition K de Fulton

Cet indice est calculé à partir de la formule suivante : K = W/L³ x100

où W est le poids (en mg) et L la longueur totale (en mm) de l’individu. Le calcul du K assume une croissance isométrique du poisson puisque que la longueur est inféodée d’une puissance 3. Cette considération d’une croissance isométrique représente une approximation valide pour la plupart des espèces de poissons (Bister et al., 2000).

4.3.2 Rapport ARN/ADN

La méthodologie utilisée suit le protocole de Clemmensen (1988) basé sur la méthode d’extraction et de quantification de Munro et Fleck (1966). Le dosage des acides nucléiques est effectué pour chaque individu sur un fragment de muscle frais (50 mg). Les muscles sont

Chapitre II : Matériel et Méthodes

86 pesés puis maintenus dans de la glace durant toute la durée des manipulations pour éviter la moindre dégradation des acides nucléiques. Les échantillons sont ensuite homogénéisés à l’aide d’un Ultra Turrax dans une solution tampon Tris (0,05 M Tris-HCL, 0,1 M NaCl et 0,01 M EDTA, pH=7.5) auquel a été ajouté de la protéinase K (0.2 mg.mL^-1). La protéinase K a pour but de digérer les matrices protéiques des cellules. Aux échantillons, est ajouté 30 µL de SDS 20% (sodium dodécyl sulfate) qui lyse les cellules.

L’extraction est effectuée dans un premier temps par ajout de 300 µ L de phénol (SIGMA) qui a la propriété de désintégrer les protéines. Un volume de 300 µL de chloroforme isoamylalcool (SIGMA) est également ajouté afin de permettre la solubilisation des lipides et protéines et ainsi de les retirer de la phase nucléique qui est récupérée après centrifugation (4°C, 6000 rpm, 10 min). Cette étape est renouvelée. La seconde étape consiste à ajouter uniquement 300 µ L de chloroforme isoamylalcool (24:1), ce qui permet notamment d’éliminer les traces éventuelles de phénol. La phase nucléique est récupérée par centrifugation (4°C, 6000 rpm, 5 min), la procédure est renouvelée et 200µ L de tampon Tris est ajouté.

La détermination des acides nucléiques est effectuée par méthode fluorimétrique. Un volume de 5 µL de bromure d’éthidium (BET, SIGMA), fluorophore spécifique des acides nucléiques (Karsten et Wollenberger, 1977), est ajouté à 45 µ L d’échantillon dans des microplaques de 96 puits. L’intensité de fluorescence de ce marqueur varie linéairement avec la concentration d’acides nucléiques. La fluorescence des acides nucléiques totaux (ARN + ADN) est alors mesurée au spectrofluorimètre mis à disposition par le LEMA (Université du Havre), sous longueur d’onde d’excitation de 360 nm et longueur d’onde d’émission de 590 nm. Un aliquot de l’échantillon est ensuite incubé à 37°C durant une heure avec 0,3 µ L de ribonucléase A (0,02 mg.mL^-1). Une seconde lecture au spectrofluorimètre détermine ainsi la fluorescence due aux ADN uniquement. La fluorescence en ARN est alors déduite en soustrayant la fluorescence totale (ARN + ADN) à celle de l’ADN. Ces fluorescences sont ensuite converties en ng.µ L^-1 à l’aide de droites d’étalonnages préalablement établies à partir d’ADN standard de sperme de saumon (SIGMA) et d’ARN de levure type III (SIGMA) (Figure 31).

Chapitre II : Matériel et Méthodes 87 y = 24,92x R² = 0,9831 y = 20,60x R² = 0,9958 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 100 200 300 400 500 concentration (ng.µL^-1) F lu o re s c e n c e ( U A ) ADN ARN

Figure 31 : Droites d’étalonnage des concentrations d’ADN et d’ARN en fonction de la fluorescence émise par le bromure d’ethidium (BET), fluorophore spécifique des acides nucléiques.

4.3.3 Indice lipidique : rapport TAG/ST

L’analyse des teneurs en lipides est effectuée à partir d’échantillons de muscle. Dans un premier temps, 300 à 400 mg de muscles (poids humide) sont prélevés, puis lyophilisés (24 h) afin de déterminer le poids sec. Les échantillons sont ensuite conservés dans de l’azote gazeux afin d’éviter l’oxydation des muscles. L’extraction des lipides est effectuée selon la méthode de Bligh et Dyer (1959), légèrement modifiée. Les cellules musculaires sont désintégrées par sonication (T°C <40°C, 20 min) dans un mélange d’eau Milli-Q:méthanol:chloroforme (1:2:1, v:v:v) (Fisher Scientist). Le chloroforme (CHCl3) extrait principalement les lipides « neutres » (les triglycérides), alors que le méthanol (CH3OH) extrait les lipides membranaires (phospholipides, glycoprotéines). L’ajout d’eau Milli-Q:chloroforme (1:1, v:v) permet d’obtenir un complexe à deux phases, l’une organique, l’autre aqueuse. Les lipides sont transférés dans la couche inférieure correspondant au chloroforme après centrifugation (5 min à 3000 trs.min^-1). La phase organique est alors extraite et la phase aqueuse subit une seconde extraction au chloroforme (2, v). Les deux couches de chloroforme séparées sont combinées et évaporées à l’aide d’un évaporateur rotatif. Suite à cette évaporation, 3 x 1 mL de chloroforme sont ajoutés afin de collecter les lipides extraits. Après évaporation d’une partie du volume sous flux léger d’azote, l’extrait

Chapitre II : Matériel et Méthodes

88 lipidique est transféré dans un vial en verre de 2 mL (préalablement pesé à vide) et évaporé une seconde fois. Les lipides totaux ainsi obtenus sont pesés (mg.g^-1 de poids sec) et redissous dans un mélange de chloroforme:méthanol (2:1).

Les classes lipidiques sont séparées par chromatographie sur couche mince (CCM). Les plaques de chromatographie (DC Gel de Silice 60) sont constituées d’une feuille de verre (10 cm x 10 cm) sur laquelle repose une fine couche de gel de silice (SIGMA). Dans la majorité des cas, deux injections de 5 µL (10 µ L) sont utilisées pour chaque échantillon. L’éluant utilisé pour la migration est un mélange d’hexane:diethylether:acide acétique (16:4:0,2, v:v:v) (Fisher Scientist). Après migration (11 min), le chromatogramme est immergé dans une solution fixatrice acide orthophosphorique (33%) :acide acétique :acide sulfurique (0,5%) :sulfate de cuivre (20:20:2:360) (Fisher Scientist) durant 2 min 30 s. Le chromatogramme est ensuite séché à l’air chaud et les classes lipides sont révélées sur plaque chauffante 45 min à 120°C. Le chromatogramme est finalement scanné et enregistré sous format JPEG. Un programme d’analyse d’image (NIH image, image J windows 1.41) est utilisé afin de déterminer la contribution relative de chaque classe lipidique en intégrant la surface du chromatogramme concerné. Avec cette méthode, il est possible de déterminer six classes lipidiques (phospholipides, acides gras, stérols, triglycérides, stérols esters, cirres) dont la quantité est exprimée en µg.g^-1 de poids sec (Figures 32 et 33). Le rapport TAG/ST peut alors être calculé.

Figure 32 : Détermination des classes lipidiques par migration sur plaque TLC obtenues après injection d’un extrait lipidique de fragment de muscle de juvénile de turbot, Scophthalmus maximus.

Phospholipides (Ph) STEROLS (ST) Acides gras (AG)

TRIACYLGLYCEROLS (TAG)

Esters

Chapitre II : Matériel et Méthodes

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Figure 33 : Détermination des classes lipidiques par intégration des niveaux de gris après scannage d’une plaque TLC obtenues après injection d’un extrait lipidique de fragment de muscle de juvénile de

turbot, Scophthalmus maximus.